PD-10脱盐柱平衡、上样、洗脱、再生全流程及操作要点
PD-10 脱盐柱从平衡到再生的五步流程
平衡 PD-10脱盐柱：先让床体进入工作状态新柱从包装里拿出来，先把顶部盖子和底盖都打开，让柱里自带的保存液靠重力流干，注意别让液面降到床面以下——床体一旦干掉会出现沟流，这根柱基本就废了。
用你后面要置换进去的缓冲液平衡，体积 25 mL 左右，分次加进去让它自然流过。平衡液的 pH、盐浓度、是否加甘油或还原剂，都按下游实验定，柱子本身不挑。平衡完让液面刚好落到床面上方一点点，准备上样。
上样：2.5 mL 是硬上限
样品最多加 2.5 mL，这是柱床体积决定的，不是建议值。样品太稀就提前用超滤管浓缩，别想着分两次上样能提高回收率——第二次上样时第一批盐已经在分离路径上，分辨率会塌掉。
加样时枪头贴着柱壁缓慢打进去，避免冲起床面。等样品全部进入床体、液面重新落到床面，再开始下一步洗脱。上样过程中流出来的液体含盐和小分子杂质，直接弃掉，不要收集。
PD-10 脱盐柱（Sephadex G-25 介质），重力流操作
洗脱目标蛋白：3.5 mL 收目标峰样品进床后加 3.5 mL 缓冲液洗脱，这一段流出来的就是脱盐后的蛋白，用一支干净管子整段接住。原理很直白：Sephadex G-25 的孔径允许盐和小分子进入颗粒内部、走的路径长，大分子蛋白被排阻在颗粒外、路径短，所以蛋白先出来，盐后出来。
如果样品体积小于 2.5 mL，洗脱体积也要相应微调，但常规实验直接按 2.5 + 3.5 这套组合做最稳。洗脱全程靠重力，不要用针筒加压，流速异常升高往往意味着床体已经有沟道。
再生与保存：一次性使用更划算
PD-10 出厂定位就是单次使用，官方不建议反复再生。非要重复用，至少用 5 倍柱体积的缓冲液冲洗，并确认上一次样品无强吸附、无生物污染；但重复使用的柱效、回收率和除盐率都没有保证，做关键样品不建议省这个钱。
核对关键参数：动手前扫一眼
判断结果：除盐率和回收率怎么验
脱盐完别只看蛋白浓度，顺手测两个指标。小分子去除情况可以用电导率仪测洗脱液电导率，跟目标缓冲液对比，电导率明显偏高说明盐没分干净；有分光光度计的话，按你的小分子种类选波长扫一下更直接。
蛋白回收率用 A280 或 Bradford 测收集液总量，正常操作下大分子回收率通常能做到较高水平，具体数值跟样品性质有关。如果回收率低，先排查上样体积是否超限、床面是否干掉、洗脱体积是否给够，这三个是最常见的原因。
把 2.5 和 3.5 这两个数记住，PD-10脱盐柱一次就能跑顺。
标签：
脱盐柱
