重组蛋白结构生物学纯化攻略

结构生物学研究对蛋白样品的要求
无论通过何种方式解析蛋白结构，均对蛋白纯度有较高的要求，需要蛋白的纯度至少高于99%；此外也需要样品保持表面电荷均一，表面疏水均一和聚合均一。这就需要我们对纯化方法和策略进行优化，以达到结构解析的要求，以下是小优的可靠优化建议。

纯化前的样品处理

针头滤器
为了防止层析柱堵塞，需要对样品和缓冲液进行过滤。

1、滤膜孔径
0.45um和0.2um滤膜如何选择？小优建议：
可以根据层析柱填料的粒径确定滤膜的孔径。
· 常规的填料和预装柱的样品可以使用0.45um滤膜进行过滤；
· 如果使用超高分辨率的层析柱，例如Superdex 30/75/200 Increase系列分子筛；Capto HiRes Q/S系列离子交换层析柱，建议样品预先使用0.2um滤膜进行过滤。

2、滤膜材质
优先选择低蛋白吸附的滤膜，减少样品损失。小优建议：
· PES和RC膜比较适合蛋白样品过滤；
· PVDF，NC，尼龙膜等蛋白吸附较高；不建议使用；

3、 滤膜有效过滤面积
膜面积太小过滤速度慢，膜面积太大样品损耗多。小优建议：
· 样品体积小于2ml，选择4mm针头滤器；
· 样品体积在2ml和10ml之间，选择10/13mm针头滤器；
· 样品体积大于10ml，选择25/30mm针头滤器；

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超滤离心管
如果样品量太大，此时需要使用超滤离心管对样品进行浓缩。分子筛的上样量为柱体积的2%左右，建议浓缩后进行上样；

1、超滤管MWCO
超滤管截留分子量MWCO表明超滤管的截留性能，标称MWCO能截留90%的该尺寸的球形蛋白。小优建议：
· 如果想要提高流速，MWCO应为目标蛋白分子量的1/3；
· 希望保证最大回收时，MWCO应为目标蛋白的1/6；
· 目标蛋白为线性分子如DNA，建议选择较小的MWCO如1/6及以上；

2、蛋白吸附在膜上
蛋白在离心后吸附在超滤膜上，会造成蛋白样品的损失。小优建议：
· 优化回收方法：用移液枪吹打滤膜回收样品，避免枪头直接碰触膜片；
· 优化离心力：不要过高，蛋白参考3500g以内；
· 优化离心条件：短时间多次离心，步骤间吹打混匀；超滤膜面不要正对转子中心；
· 不要过度离心，到达截停体积则样品无法继续浓缩；

3、浓缩慢
过滤速度受到MWCO，样品浓度&粘度，离心力和温度的影响。小优建议：
· 如果样品中固体含量超过5%时，离心时间需要增加；
· 在4℃低温离心的条件下，流速会比25℃时慢1.5倍，需要适当延长离心时间；
· 样品粘性比较大时（例如含有50%甘油），浓缩时间应为常规水溶液的6倍；

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样品纯化路线设计
想要解析蛋白结构，对蛋白的纯度，均一性，聚合状态等都有较高的要求，往往一步纯化很难达到想要的目标。
多种纯化技术如何进行合理的搭配？小优建议：
第一步使用标签亲和层析，可以快速的吸附和稳定样品。这一步基本可以达到90%纯度；
· 如果样品杂带较少，不会形成包涵体，使用His标签就可以；
· 如果样品容易形成包涵体，使用GST或者MBP标签；
· 如果样品杂带较多，使用Strep或者Flag标签；
· 如果纯化后需要切除标签，使用Protein Select自切除标签；

第二步使用凝胶过滤层析，进一步提高纯度；
如果样品中还是存在较难分离的杂带，或者表面电荷和疏水性不均一，可以在亲和层析和凝胶过滤层析中间加上离子交换层析&疏水层析步骤；

亲和层析
1、咪唑使用方法
His标签蛋白纯化的成功率和咪唑使用方法关系很大。咪唑是His标签的类似物，可以通过竞争性洗脱的方式将His标签目标蛋白洗脱下来。
咪唑到底应该怎么加？小优建议：
· 在结合缓冲液中可以适当加入20-40mM咪唑，以减少非特异性蛋白对柱子的吸附；
· 在洗脱时，使用0-500mM咪唑的线性梯度洗脱10 CV，以摸索在哪一个咪唑浓度下，目标蛋白的得率和纯度较高；

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2、GST标签切除酶的选择
GST标签分子量比较大，在结构生物学研究中需要切除，以减少对蛋白解析的影响。
GST标签切除酶怎么选？小优建议：
· 不同标签切除酶最适酶切温度不同。例如PreScission,HRV 3C酶最适酶切温度为4℃；Thrombin，Factor Xa，Enterokinase酶最适酶切温度为22-25℃；rTEV，SUMO酶30℃ 1h或者4℃过夜，切除酶和蛋白的最适温度应保持一致；
· 标签切除酶最好和蛋白的分子量大小差异比较大，这样酶切之后，可以通过凝胶过滤层析步骤去除蛋白里面残留的切除酶，减少样品处理步骤；
· 也可以直接选择带有GST标签的PreScission酶，通过GST层析柱柱上酶切即可一步去除标签和残留酶；

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离子交换层析
1、离子交换层析介质选择
离子交换层析根据配基带电性质的不同，分为带有正电荷的阴离子交换层析柱和带有负电荷的阳离子交换层析柱。
阴离子交换和阳离子交换如何选择？小优建议：
缓冲液的pH尽量为中性，则如果蛋白等电点小于中性pH，建议使用阴离子交换柱；如果蛋白等电点大于中性pH，建议使用阳离子交换柱。

2、缓冲液pH的选择
缓冲液pH对离子交换层析的成功非常关键。如果缓冲液pH和蛋白等电点相差太小，蛋白很难吸附在柱子上；如果缓冲液pH的蛋白等电点相差太大，则蛋白很难洗脱。
缓冲液pH如何选择？小优建议：
· 缓冲液pH建议与目标蛋白的等电点相差0.5-1pH；
· 离子交换层析效果不佳时，优先考虑摸索缓冲液pH；
· 文献中使用的缓冲液种类和pH值一般是经过摸索后的，优先参考文献；

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凝胶过滤层析
1、样品体积问题
通常建议在上分子筛之前先进行样品浓缩。
样品体积会影响分离效果吗？浓缩后浓度过大会有影响吗？小优建议：
· 分子筛的上样体积应限制为层析柱体积的2%-5%。样品体积太大会严重影响分离效果，因此建议减小样品体积；
· 样品浓度过大通常对分离效果没有影响，一般样品浓度小于50 mg/ml是可以的。需要注意样品一次性浓缩过大可能会造成样品析出，可以使用多次浓缩的方法；

2、目标蛋白和杂蛋白分不开
· 目标蛋白和杂蛋白在一个峰里，此时很难通过收集分离目标蛋白和杂蛋白。小优建议：
· 目标蛋白和杂蛋白分子量是否差别两倍以上，如果分子量差别不大，建议使用离子交换；
· 降低上样体积和运行流速；
· 选择粒径更小，分辨率更高的分子筛，例如Superdex 75/200 Increase系列；

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