标记和修饰抗体的蛋白质交联新方法Buccutite共轭法研究
简 介
两个大生物分子间的共价结合，是研究人员的一项重要任务，例如酶的抗体或DNA的酶。有多种可用于交联两种生物分子的方法，其中最常见的方法，就是使用小交联剂（如磺化SMCC）。SMCC一端具有胺反应的NHS脂与蛋白质的游离胺（-NH2）反应，另一端具有巯基反应的马来酰亚胺基与生物分子的巯基（-SH）反应。SMCC修饰的蛋白质接头是非常不稳定的，通常是自反应的，因为蛋白质通常含有游离胺和巯基，导致大量的同位交联。另外，蛋白质上马来酰亚胺基团数目的定量是繁琐的，而且很难确定两个生物分子在反应中联接的合适的摩尔比以达到理想的功能和偶联效率。
现在，有一种简单有效的交联方法，将两个高共轭率的生物分子连接起来。该方法使用两种独特的交联剂（Buccutite MAT和Buccutite FOL）。MAT和FOL蛋白的交联剂易于控制和量化。经过脱盐柱去除游离连接物后，Buccutite MAT激活的抗体和Buccutite FOL修饰的蛋白质在温和条件下混合后易发生反应。从本质上讲，这种纯化是不必要的，而且在反应中没有同位交联的生物分子。
使用Buccutite MAT和Buccutite FOL的交联方法
材料和方法
抗体和酶：山羊抗小鼠lgG和小鼠lgG来自Jacksonm免疫研究实验室，HRP来自Calzyme，微管蛋白小鼠mAb来自Life Technologies.
净化柱：所有的净化柱都来自Bio-Rad的Bio-Spin尺寸排除柱。
细胞成像：Hela细胞用4%甲醛固定，用小鼠抗微管蛋白染色，然后用HPR-Goat-Anti-Mouse lgG缀合物染色。用Olympus IX71荧光显微镜成像。
共轭原理
1.用MAT激活山羊抗小鼠lgG，用FOL（1小时）修饰标签蛋白（APC或PE）。
2.用旋转柱（5min）对激活的lgG5和修饰的标记蛋白进行纯化。
3.将活化的抗体和修饰的标记蛋白混合30分钟。
4.用所需的共轭物染色细胞，无需纯化。
抗体蛋白质结合过程
结 果
用于ELISA检测的HRP-lgG共轭物
用Buccutite交联技术（红色）和SMCC方法（蓝色）制备HPR-山羊-抗小鼠lgG共轭物，产生直接ELISA曲线。将小鼠单克隆抗体（100ng）包被在96孔板上，用标准方法将GAM lgG-HRP共轭物稀释为2倍稀释系列。使用ABTS底物溶液（#11001）检测30分钟并在405nm读取的固定化小鼠lgG.
用于细胞成像的lgG-RPE共轭物
在Hela细胞中用RPE-山羊-抗小鼠lgG共轭物对微管蛋白进行成像。使用小鼠抗α-微管蛋白抗体对微管蛋白进行染色，并如上所述用Buccutite交联技术制备的红色荧光RPE-山羊-抗小鼠lgG共轭物显现。
结 论
1.连接器非常稳定。Buccutite接头激活的大分子非常稳定，可以在4℃下储存超过24个月。
2.共轭条件是非常温和和强大的。Buccutite结合物可以在PH、浓度和温度范围内运行，不需要催化剂。
3.高效率：Buccutite共轭可在1小时内完成。在相同条件下，Buccutite共轭法比其他现有的方法具有更高的产率，共轭可以在极低的浓度下进行。
两个大生物分子间的共价结合，是研究人员的一项重要任务，例如酶的抗体或DNA的酶。有多种可用于交联两种生物分子的方法，其中最常见的方法，就是使用小交联剂（如磺化SMCC）。SMCC一端具有胺反应的NHS脂与蛋白质的游离胺（-NH2）反应，另一端具有巯基反应的马来酰亚胺基与生物分子的巯基（-SH）反应。SMCC修饰的蛋白质接头是非常不稳定的，通常是自反应的，因为蛋白质通常含有游离胺和巯基，导致大量的同位交联。另外，蛋白质上马来酰亚胺基团数目的定量是繁琐的，而且很难确定两个生物分子在反应中联接的合适的摩尔比以达到理想的功能和偶联效率。
现在，有一种简单有效的交联方法，将两个高共轭率的生物分子连接起来。该方法使用两种独特的交联剂（Buccutite MAT和Buccutite FOL）。MAT和FOL蛋白的交联剂易于控制和量化。经过脱盐柱去除游离连接物后，Buccutite MAT激活的抗体和Buccutite FOL修饰的蛋白质在温和条件下混合后易发生反应。从本质上讲，这种纯化是不必要的，而且在反应中没有同位交联的生物分子。
使用Buccutite MAT和Buccutite FOL的交联方法
材料和方法
抗体和酶：山羊抗小鼠lgG和小鼠lgG来自Jacksonm免疫研究实验室，HRP来自Calzyme，微管蛋白小鼠mAb来自Life Technologies.
净化柱：所有的净化柱都来自Bio-Rad的Bio-Spin尺寸排除柱。
细胞成像：Hela细胞用4%甲醛固定，用小鼠抗微管蛋白染色，然后用HPR-Goat-Anti-Mouse lgG缀合物染色。用Olympus IX71荧光显微镜成像。
共轭原理
1.用MAT激活山羊抗小鼠lgG，用FOL（1小时）修饰标签蛋白（APC或PE）。
2.用旋转柱（5min）对激活的lgG5和修饰的标记蛋白进行纯化。
3.将活化的抗体和修饰的标记蛋白混合30分钟。
4.用所需的共轭物染色细胞，无需纯化。
抗体蛋白质结合过程
结 果
用于ELISA检测的HRP-lgG共轭物
用Buccutite交联技术（红色）和SMCC方法（蓝色）制备HPR-山羊-抗小鼠lgG共轭物，产生直接ELISA曲线。将小鼠单克隆抗体（100ng）包被在96孔板上，用标准方法将GAM lgG-HRP共轭物稀释为2倍稀释系列。使用ABTS底物溶液（#11001）检测30分钟并在405nm读取的固定化小鼠lgG.
用于细胞成像的lgG-RPE共轭物
在Hela细胞中用RPE-山羊-抗小鼠lgG共轭物对微管蛋白进行成像。使用小鼠抗α-微管蛋白抗体对微管蛋白进行染色，并如上所述用Buccutite交联技术制备的红色荧光RPE-山羊-抗小鼠lgG共轭物显现。
结 论
1.连接器非常稳定。Buccutite接头激活的大分子非常稳定，可以在4℃下储存超过24个月。
2.共轭条件是非常温和和强大的。Buccutite结合物可以在PH、浓度和温度范围内运行，不需要催化剂。
3.高效率：Buccutite共轭可在1小时内完成。在相同条件下，Buccutite共轭法比其他现有的方法具有更高的产率，共轭可以在极低的浓度下进行。
