Cy5.5近红外荧光探针的分子成像应用研究
▲ Cy5.5 (TD0091)，CAS: 210892-23-2的化学结构式
Cy5.5 (TD0091)，CAS: 210892-23-2 的作用机制属于光物理过程：在近红外区被激发后，Cy5.5 从基态跃迁至单重激发态并经辐射弛豫发射更长波长光子。其扩展共轭结构带来高消光系数与近红外发射，使其位于组织自体荧光较低且血红蛋白、黑色素吸收较弱的光学窗口中，从而在小型动物体内获得更高信噪比与更深光子传播 [1,2]。Cy5.5 的发光强度与其在局部微环境中的有效浓度及微观相互作用相关，在受控照明与采集条件下可实现定量读出。
在生物学应用上，Cy5.5 作为光学报告元件可与蛋白、抗体、肽、核酸及纳米颗粒等共价连接，使这些载体具备近红外可视化能力，用于在体示踪分布、靶向结合、细胞摄取与清除等过程。Cy5.5 并不依赖特定受体，而是将分子事件耦合至由荧光团、激发光源、组织内光子传输与探测器构成的“光信号通路”。在该通路中，Cy5.5 可与光谱匹配的伙伴形成 FRET 体系，或构建自淬灭“可激活”探针：当蛋白酶切割、构象转换或受体介导的解离改变染料间距离时，淬灭被解除并产生增强的近红外信号，从而把生化活性转换为可量化的光学读数 [1,2]。通过调控 Cy5.5 在载体上的标记位点与标记密度，可精细控制福斯特距离、淬灭效率及对极性、蛋白结合等环境因素的敏感性，从而调制该光学通路的信号转换效率。
将 Cy5.5 融入探针后，可对配体–受体结合、内吞或酶活性等关键过程进行时空分辨成像：抗体–Cy5.5 可可视化高表达受体组织；肽–Cy5.5 可反映富含蛋白酶的微环境；核酸–Cy5.5 可示踪递送与杂交状态；纳米颗粒–Cy5.5 可跟踪由理化参数决定的体内转运。于近红外断层或大视野成像中，Cy5.5 支持全身尺度的光谱分离与多重成像；在活体显微镜下，则凭借低自体荧光背景实现亚细胞定位 [1,2]。这些特性使 Cy5.5 能高效将生物信息转化为近红外信号，特别适合小动物在体成像中用于研究分子通路、靶点验证与纳米载体设计。
■ 2. 文献分享
■ 2.1 A Unique Recombinant Fluoroprobe Targeting Activated Platelets Allows In Vivo Detection of Arterial Thrombosis and Pulmonary Embolism Using a Novel Three-Dimensional Fluorescence Emission Computed Tomography (FLECT) Technology
Cy5.5 (TD0091) 在文中被描述为一种研究广泛的氰ine染料，已用于多种体外与离体免疫荧光显微成像，且其光谱参数明确，激发峰为673 nm、发射峰为707 nm。作者进一步指出，作为该类染料的一员，Cy5.5 具备高摩尔吸光系数、良好光稳定性以及强荧光发射等近红外探针的优良特性。文中还说明，包括 Cy5.5 在内的此类染料可与蛋白质或抗体偶联，制备出能够特异结合并追踪目标蛋白或细胞的定向重组荧光探针，从而用于不同动物模型中的成像应用。基于这些证据，Cy5.5 兼具明确的近红外光谱特征、优异的光学表现与良好的生物偶联适配性，可用于构建面向生物靶标的成像探针并实现对相关目标在动物体内外的可视化追踪。[3]
■ 2.2 Inhibition of macrophage polarization and pyroptosis in collagen-induced arthritis through MSC-exo and ginsenoside Rh2
▲ 人参皂苷 Rh2、间充质干细胞外泌体（MSC-exo）单独及联用对 LPS 诱导细胞增殖与迁移的抑制效果。 (A) EdU 细胞增殖免疫荧光染色：DAPI 染细胞核（蓝色），EdU-555 标记增殖细胞（红色），设置 LPS 阴性对照组，处理组包括 PBS、MTX、Rh2、MSC-exo、MSC-exo+Rh2； (B) Transwell 细胞迁移结晶紫染色图片，直观展示各组穿膜细胞数量差异； (C) EdU 阳性细胞比例统计柱状图； (D) 迁移细胞数量定量统计；**、**** 代表组间统计学差异显著。
Cy5.5 (TD0091)用于对间充质干细胞来源外泌体（MSC-exo）进行荧光标记以实现体内追踪。具体操作为：向含有100 µg MSC-exo的200 µl PBS中加入10 µl、1 mM的Cy5.5，充分混匀后于室温孵育1小时。标记完成后，通过超速离心去除未结合的Cy5.5，并以PBS重悬沉淀。体内实验中，将500 µg/kg的Cy5.5标记MSC-exo经静脉注射给与CIA大鼠，另有一组在相同剂量的Cy5.5标记MSC-exo基础上联合给予Rh2。在给药后4小时这一关键时间点，采集主要器官与四肢组织并行荧光成像，以可视化已标记的MSC-exo。应用上述以Cy5.5为核心的标记与成像流程，研究报告显示，在注射Cy5.5标记MSC-exo后4小时，标记物主要富集于肝脏与肺部。上述结果说明本研究采用Cy5.5作为荧光标记以获得可追踪的MSC-exo，明确了标记与去除游离染料的步骤，界定了体内给药剂量与观测时点，并呈现了给药后4小时的器官分布情况。[4]
■ 2.3 Hyaluronic acid-coated polypeptide nanogel enhances specific distribution and therapy of tacrolimus in rheumatoid arthritis
▲ HA 修饰 TAC 载药纳米粒 HA-NG/TAC 体外安全性与靶向摄取验证。 (A) 梯度浓度 TAC 原料药、NG/TAC、HA-NG/TAC 对巨噬细胞无明显毒性； (B) NG/TAC 与 HA-NG/TAC 在三种细胞中长期培养仍生物安全； (C) HA-NG/TAC 血液溶血率极低，血液相容性合格； (D) 炎症细胞高表达 HA 受体 CD44，为 HA 介导靶向提供分子基础； (E–H) 荧光示踪证实 HA 修饰可显著提升 TAC 纳米粒在 LPS 活化炎症细胞中的内化摄取，实现化合物靶向富集。
Cy5.5 (TD0091)在本研究中作为荧光标记用于追踪分布与摄取。体内实验显示，在胶原诱导性关节炎小鼠中，注射后0.5、3、6、12与24小时的关节部位可观察到游离Cy5.5、以Cy5.5标记的纳米凝胶（NG）以及以Cy5.5标记的HA包覆纳米凝胶（HA-NG）的分布。组织学层面，代表性荧光图像显示了游离Cy5.5、以Cy5.5标记的NG与HA-NG在滑膜内的分布。体外方面，荧光图像显示，经LPS处理的RAW 264.7、MH7A与HUVEC细胞可吞噬以Cy5.5标记的NG与HA-NG。定量荧光分析结果表明，在炎性关节中，以Cy5.5标记的HA-NG组的荧光强度约为以Cy5.5标记的NG组的三倍，且具有统计学显著性。利用该荧光信号还界定了器官分布特征：以Cy5.5标记的NG组在肝与肾中可观察到显著荧光，而以Cy5.5标记的HA-NG主要分布于肝脏。研究同时指出，由增强渗透与滞留效应所致，以Cy5.5标记的NG能够到达炎性关节并分布至肝肾，与较快的清除相关。[5]
■ 2.4 Gintonin prevents paclitaxel-induced neuropathic pain via spinal LPA 3 receptors and oligodendrocyte precursor cells in mice.
▲ 化合物 G100 通过调控 LPAR 受体逆转 PAC 诱导神经病理性冷、机械性异常疼痛。 (A-B) 行为学曲线：PAC 造模引发冷痛觉异常与机械痛敏，G100 给药可显著缓解该痛觉过敏，Ki（Ki16425）可拮抗 G100 药效，H₂反向验证通路； (C) qPCR 显示 PAC 上调 Lpar1/3 mRNA，G100 可逆转该转录升高； (D-E) Western blot 验证 LPAR1/3 蛋白表达趋势与基因一致，证明化合物 G100 通过下调 LPAR1、LPAR3 受体表达发挥镇痛作用。
Cy5.5 (TD0091) 被用于给与人参皂苷相关复合物结合的分子进行荧光标记，以评估其在小鼠脊髓组织中与LPA3受体的空间关系。研究将对照组与200 mg/kg人参组（G200）的脊髓切片在体外与Cy5.5标记的复合物孵育，红色通道显示Cy5.5标记信号，绿色通道为LPA3受体免疫标记，蓝色通道为DAPI核染。图像中以白色箭头标示了共定位区域，用于指示在所制备切片中的空间重叠。为在紫杉醇处理背景下进一步检视这种关系，研究将Cy5.5标记的复合物应用于来自紫杉醇处理小鼠的脊髓切片，以确认与LPA3受体的共定位。成像设置涵盖低倍与高倍观察，比例尺分别为100 μm与20 μm，从而支持在多个尺度上对已标记结构的可视化。在这一成像流程中，Cy5.5提供了红色通道的清晰标记信号，与绿色的LPA3免疫反应性并置，便于评估两通道之间的重叠情况。基于对照组与G200组的图像，白色箭头在背角区域指示出局部重叠。上述步骤共同体现了Cy5.5标记在脊髓组织中可视化该复合物与LPA3受体免疫反应性分布关系的应用。[6]
■ 2.5 Structure-Activity Relationship of Cyanine Dyes in Relation to the Hepatic Uptake and Excretion.
▲ 9 种荧光染料分子（Fluorophore 1–9）荧光强度与细胞摄取能力筛选。 (A) 归一化体外荧光强度柱状图，化合物 5、6 荧光量子效率最高； (B) 流式细胞平均荧光强度 Log (MFI) 初筛，圈出内化较优分子； (C) 统计学箱线图定量验证：化合物 6 细胞摄取水平显著低于 5、9，化合物 5、9 具备最优细胞穿透与荧光示踪性能，**** 为极显著差异，ns 无统计学差异。
Cy5.5 (TD0091) 被纳入一组按芳香环数逐级扩展的氰ine染料矩阵中进行评估，序列由Cy5递进至Cy5.25再到Cy5.5。实验结果显示，每在氰ine骨架上增加一个苯环，吸收/发射峰均出现约20 nm的红移；据此，Cy5.5（在该研究中由具有两个额外苯环的3、6、9号化合物代表）位于该系列红移程度最大的末端。同时，随芳香基团的引入，亮度呈递减趋势，表现为从Cy5到Cy5.25再到Cy5.5逐步降低，因此Cy5.5变体在所测染料中处于较低亮度水平。上述结果将Cy5.5明确置于一个由结构扩展所驱动的性质变化路径之中：芳香共轭长度的增加一方面带来可预期的吸收/发射红移，另一方面伴随亮度的降低。研究对Cy5.5与“两枚额外苯环”的对应关系给予了明确界定，使得这些光物理表现能够直接归因于Cy5.5，并清晰展示其在该设计序列中的位置与特征。[7]
■ 3. 结语Cy5.5的作用机制基于光物理过程：在近红外激发光照射下，分子从基态跃迁至单重激发态，随后通过辐射弛豫发射较长波长光子。其扩展的π共轭结构赋予Cy5.5高消光系数和位于组织低自体荧光及血红蛋白、黑色素吸收弱光学窗口的发射特性，实现深层组织穿透和高信噪比。文献显示，Cy5.5可通过共价连接蛋白、抗体、肽、核酸及纳米颗粒，作为灵活的近红外光学报告元件，用于体内示踪分布、靶向结合及生化活性转导，如FRET及可激活探针。其应用涵盖间充质干细胞外泌体追踪、炎症纳米凝胶分布监测及配体-受体相互作用成像等多个动物模型。未来研究可聚焦于优化Cy5.5标记策略以提升信号转导效率，拓展多重成像能力，并开发新型可激活探针，实现分子通路的精准时空动态成像。
■ 4. Q&AQ1: Cy5.5发射荧光的基本机制是什么？
A1: Cy5.5通过吸收近红外激发光，使分子从基态跃迁至单重激发态，随后通过辐射弛豫发射更长波长的光子，实现荧光发射。
Q2: 文献中Cy5.5在生物学应用中如何被使用？
A2: Cy5.5通过共价连接蛋白、抗体、肽、核酸及纳米颗粒，作为光学报告元件，实现体内分布、靶向结合、转运及生化活性的近红外可视化，包含FRET和可激活探针的应用。
Q3: 文中提到的Cy5.5应用示例有哪些？
A3: 包括在胶原诱导性关节炎模型中追踪间充质干细胞外泌体、监测HA包覆纳米凝胶在炎症关节的分布与摄取，以及在小鼠脊髓组织中可视化人参皂苷复合物与LPA3受体的空间关系。
■ 5. 参考文献[1] Weissleder R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 2001;19(4):316-317.
[2] Ntziachristos V, Ripoll J, Wang LV, Weissleder R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 2005;23(3):313-320.
[3] Lim B, Yao Y, Huang A, Yap M, Flierl U, Palasubramaniam J, et al.. A Unique Recombinant Fluoroprobe Targeting Activated Platelets Allows In Vivo Detection of Arterial Thrombosis and Pulmonary Embolism Using a Novel Three-Dimensional Fluorescence Emission Computed Tomography (FLECT) Technology. Theranostics. 2017;7(5):1047-1061.
[4] Zhou Z, Wu S, Li Y, Shao P, Jiang J. Inhibition of macrophage polarization and pyroptosis in collagen-induced arthritis through MSC-exo and ginsenoside Rh2. Arthritis Research & Therapy. 2025;27(1):.
[5] Li Y, Wang X, Gao Y, Zhang Z, Liu T, Zhang Z, et al.. Hyaluronic acid-coated polypeptide nanogel enhances specific distribution and therapy of tacrolimus in rheumatoid arthritis. Journal of Nanobiotechnology. 2024;22(1):.
[6] Park K, Jo H, Nah S, Jin Y, Cho I, Kim W. Gintonin prevents paclitaxel-induced neuropathic pain via spinal LPA 3 receptors and oligodendrocyte precursor cells in mice.. Journal of ginseng research. 2026;50(4):101047.
[7] Berehova N, de Bock E, van Meerbeek M, Naar C, van den Eng T, Bouw N, et al.. Structure-Activity Relationship of Cyanine Dyes in Relation to the Hepatic Uptake and Excretion.. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 2026;27(8):e202500762.
