类器官固定包埋实验具体步骤

1.类器官收集
收集生长至较大尺寸类器官：96孔板，生长密度较大时，使用移液枪取半孔以上，清洗1至3遍，洗去大部分基质胶，离心沉淀，弃除大部分上清。

2.琼脂糖固定槽制备（可一次制备一批，温密闭保存）
1）称量0.2至0.4g琼脂糖，加入至烧杯或者小试剂瓶内；
2）加入10mL左右PBS；
3）微波炉高火融化，每隔5s暂停打开，观察，重复数次至琼脂糖融化完全；
4）取约200uL融化琼脂糖，加入至600uL EP管内；
5）在盛有琼脂糖的小EP管内插入一小PCR管，使琼脂糖形成一圆尖底凹槽，室温或者4℃冰箱静置数分钟，至琼脂糖凝固，轻轻转动小PCR管，取出PCR管，可看到琼脂糖内形成一个深圆尖底槽。

3.类器官固定
1）将类器官轻轻吸出转移至一固定槽底部；
2）轻轻加入PBS至高于琼脂糖槽的边缘；
3）盖上盖子，水平离心机1000 rpm，离心5min；
4）轻轻吸出除底部类器官沉淀外的PBS上清；
5）加入融化的琼脂糖液体200μL；
6）室温静置至琼脂糖完全凝固；
7）剪去固定管的底部和盖子，置于2 mL EP管内，加入多聚甲醛至差不多装满整个EP管，置于4℃冰箱过夜。

4.类器官包埋
1）脱水：取出已凝固的含有类器官沉淀的琼脂糖块，在梯度乙醇中脱水，70%、80%、90%、95%乙醇各1h，100%乙醇30min,待其凝固。
2）融蜡：提前4h左右打开烘箱，65℃溶蜡。
3）透明：将脱水完成后的琼脂糖块转移至组织包埋盒中（二甲苯处理前需一直浸泡在无水乙醇中），将包埋盒转移至二甲苯中5min处理两次
注：因二甲苯有毒性，需在通风良好区域进行操作，取出时尽量沥尽残留二甲苯。
4）浸蜡：透明化处理完成后立即转入已经融化的蜡缸中，60℃浸蜡2h后，更换新的蜡缸再次浸蜡2h。
5）包埋：包埋在冰盒上进行，将融好的纯蜡倒入蜡盒三分之一处，将琼脂块放置于中间位置，然后再滴蜡包埋直到倒满。待蜡块完全凝固后，小心脱下模具。

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