从脐静脉分离干细胞操作步骤

从脐静脉分离干细胞

试剂和材料：
1.培养基：完全LG-DMEM：含2mmol/L的左旋谷氨酰胺的低糖DMEM，添加10%热灭活胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素；
2.A；
3.胰蛋白酶，0.05%，含EDTA；
4.胶原酶A，0.1%用A配制；
5.培养瓶；
6.导管；

实验方法：
1.在正常分娩后6-12h内收集和处理脐带；
2.在脐静脉内插入导管，用A完全地洗2次；
3.夹住远端脐带；
4.用0.1%胶原酶溶液充满静脉；
5.夹住近端脐带；
6.将脐带在37℃孵育20min；
7.轻轻按摩脐带，收集含有内皮和内皮下层细胞的悬浮液，600g离心10min；
8.用培养基重悬细胞；
9.计数后，按1&time10³个细胞/cm2的密度将细胞接种到75cm²的培养瓶中；
10.3天后更换培养基，除去未贴壁细胞，保留贴壁的细胞继续生长，每3天更换一次新鲜培养基，至大约2周后可见成纤维样细胞生长；
11.在这种情况下，用0.25%胰蛋白酶/EDTA收集细胞，传代到新培养瓶中继续扩增；