细胞技术专题：大鼠星型胶质细胞培养实验
大鼠星型胶质细胞培养可以：（1）用于神经系统发育、分化及再生等基础研究；（2）脑缺血预处理上调神经保护蛋白的机制研究；（3）脑损伤和脑疼痛的研究；（4）新蛋白的功能研究。
实验方法
- 酶消化法
- 胰酶消化法
- 胰蛋白酶消化法
| 实验方法原理 | 大鼠星形胶质细胞原代培养后，作胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定，应用缺氧D-Hank液及缺氧培养罐行OGD后用台盼蓝染色及乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测细胞损伤程度。 |
|---|---|
| 实验材料 |
Wistar大鼠乳鼠 |
| 试剂、试剂盒 |
FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精 |
| 仪器、耗材 |
眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱 |
| 实验步骤 |
一、实验步骤
1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠，经75%酒精消毒，断头处死。
2. 取脑放入冷的D-Hanks’平衡盐溶液，去除脑膜及大血管。
3. 分离两侧大脑皮质并剪成1mm3 大小，加入0.25%胰蛋白酶37℃空气浴震荡消化10 min。
4. 用含10% FBS的DMEM培养基终止消化，离心(1 000 rpm，10 min)，去上清。
5. 用含10% FBS的DMEM培养基重悬沉淀，经75 µm 筛网过滤，收集滤液，再次离心10 min，收集沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬，调整细胞密度至1.5×106/ml，种植于75 cm2 培养瓶。
6. 经1 小时差速黏附去除成纤维细胞后，将细胞悬液转移到一新的75 cm2 培养瓶继续培养，两天换液一次。
7. 7 天后将培养瓶放入水平摇床(260 rpm，2 h，37℃)，换液弃除小胶质细胞，放入培养箱平衡1 小时，重新置于水平摇床18 h。
8. 换液弃除少突胶质细胞，用新鲜培养基洗2 遍，加入0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA 1:1 混合液消化、传代备用。 二、 形态学观察
倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长状况。 三、 细胞生长曲线绘制
传代后的细胞以 2×104/ml 的密度种植于24 孔培养板中培养，3 天换液1 次， 每24 小时取3 孔计数，连续7 天，取均值绘制生长曲线。 四、星型胶质细胞的鉴定
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞组织化学鉴定方法。取星型胶质细胞去除培养基，用PBS洗3 遍，4%多聚甲醛室温固定1 小时，PBS洗3 次，每次5 分钟，0.3% H2O2 30 分钟以去除内源性过氧化物，PBS洗3 次每次5 分钟，加含0.5% Triton X-100 的山羊血清封闭30 分钟，滴加兔抗GFAP 抗体(1:75)，4℃ 18 小时，PBS洗3 次每次5 分钟，滴加生物素标记羊抗兔IgG，室温20 分钟，PBS洗3 次，每次5 分钟，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温20 分钟，PBS洗3 次，每次5 分钟，DAB显色。 1. 形态学观察：光镜下，传代的星型胶质细胞折光性强，形状不规则，主要为多角形，胞体大而扁平、胞质丰富，细胞核圆形或卵圆形，偏于胞体一侧，内有1-2 个核仁，有多个粗短枝状初级胞突，部分细胞突起变细变长，6-7 天后细胞融合成单层，符合神经胶质细胞生长特性，如下图。  星型胶质细胞单层生长(×100)  图1：星型胶质细胞形成融合状，单层生长(×200)
2. 鉴定：细胞经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色98%以上均为细胞浆着色，而胞核未见着色，见下图，证明采用上述方法获得的细胞为星型胶质细胞，纯度高， 可用于实验。
 图2：免疫组化鉴定，GFAP 染色
3. 细胞生长曲线绘制如下：  图3：细胞生长曲线 |
| 实验材料 |
SD大鼠 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 |
苯巴比妥 解剖液 胰蛋白酶 Dnase DM培养液 |
| 仪器、耗材 |
离心管 培养箱 手术器材 |
| 实验步骤 |
一、 取14.5d SD大鼠一只。
二、 苯巴比妥0.5 ml 腹腔注射，待麻醉后置于手术台上，酒精棉球消毒皮肤，开腹取出子宫（约12-14个），放入解剖液中，剖开子宫，取出胚胎，放入解剖液中，在耳眼之间离断，取头侧部组织，去除脑膜组织，取原始中脑区组织，放入离心管装的解剖液中，待全部取出后，1500转2分钟。 三、 用吸管吸出上清液，在组织细胞沉淀中加入胰蛋白酶一管（1 ml/vial），室温30分钟，1500转，离心5分钟（离心前可加入解剖液以终止胰酶作用）。 四、吸去上清，在组织细胞沉淀中加入Dnase 一管（2 ml/vial），37℃反应10分钟，1500转，离心5分钟，吸去上清，在组织细胞沉淀中加入2 ml DM培养液吹打，计数（计数公式为（N1+N2+N3+N4）/4*10 4），以3*105个/瓶在培养瓶中培养，做好标记（时间、原代还是第几代传代，姓名，细胞名称等），放入培养箱中培养。 |
| 注意事项 |
1. 麻醉药剂量应梢大于普通用量。
展开 2. 一定要仔细剔除干净脑膜组织，否则会极大地影响培养细胞的纯度。 3. 细胞培养技术不同于分子生物学，由于离心速度较慢，离心组织和细胞贴壁不如核酸紧密，取出离心后的上清液时一定要用吸管吸取，禁止用倾倒的方法。 4. 为保护胚胎，胚胎操作应在放置冰块的托盘中进行，保持低温。 5. 取中脑组织时应先用两把镊子夹住所取区域，然后用刀片切开。 6. 胰酶在细胞离心时会对细胞产生毒性，所以胰酶离心前可加入一定的解剖液稀释。 7. 细胞离心时最好在冰冻离心机内进行，以保持细胞活力。 8. 吹打细胞前用火烧吸管头，发红时逐渐后退，使吸管尖变钝，减少吹打过程中对细胞的损害，实验中也发现吹打时有一定的阻力。 9. 鼠胚胎较多时可分批消化，否则体外时间较长，细胞存活率低。 10. 用Neurobasal medium + B27。 11. 胰酶消化时加入EDTA可增强消化效果。 12. 关键在于取材的准确和原代细胞的状态。 |
| 实验材料 |
大鼠胚胎 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 |
L-15培养基 胶原酶 Dnase D-MEM-BS FCS-DMEM 阿糖胞苷 |
| 仪器、耗材 |
离心机 水浴锅 培养瓶 培养箱 |
| 实验步骤 |
一、分离大鼠胚胎（16-18周）新皮层，置于L-15（或Hank’s平衡盐/DMEM溶液，无Hepes）培养基中，除去脑膜和血管、海马、尾核和其他非皮层组织。 二、 用解剖刀将其切成1 mm3大小的组织块。 三、用1ml枪头转移250 μl胶原酶储存液（1.33%，溶于L-15中）到1ml的L-15（或D-MEM）中。每2只鼠脑组织块使用1-1.5 ml稀释胶原酶液。 四、37℃水浴中孵育30 min。 五、1 000 rpm(大约230g)中离心5 min，或3 000 rpm(大约2 000 g)中离心1 min。 六、去上清。 七、在含EDTA-CMF的溶液中重悬细胞，并与胰蛋白酶以1：4～1：10比例混合。可以根据观察到的细胞消化的情况，适当调整两者的比例。 八、加入胰蛋白酶的抑制剂和DNase溶液，混合5分钟。 九、1 000 rpm(大约230 g)中离心5 min，或3 000 rpm(大约2 000 g)中离心1 min。 十、去上清。加入500 μl D-MEM-BS。 十一、轻轻吹打成单细胞悬液，开始用5 ml枪头吹打10次，在需要时用18-gauge的针头吹打。( 注意：不要产生气泡。）200目/300目尼龙网过滤。 十二、将细胞转移到含10%FCS-DMEM的培养瓶中，培养密度为2X106/25 cm2培养瓶，4～6 X106/75 cm3培养瓶。在37.2℃，37.5%中培养。 十三、第2天换液，以后每隔3天换液。 十四、7-10天，细胞发生融合。 十五、细胞融合后，将瓶盖用封口膜密封好，在轨迹摇床上培养，旋转速度以不产生气泡为宜。37℃振摇过夜。细胞注意避光。 十六、去上清，加入新鲜10%FCS-DMEM。 十七、加入200 μl 1 mM的阿糖胞苷/10 ml培养基。在37.2℃，37.5%中培养孵育48小时以消除分裂的细胞。 十八、换用新鲜10%FCS-DMEM，孵育恢复24小时。 十九、重复17-18步骤，消除所有的分裂细胞 |
