感受态专题：磷酸钙法转染HEK293T细胞的介绍

一.试剂配制

无菌水ddw： 高温灭菌； 分装；

2XHBS： 280mM NaCl

10mM KCl

1.5 mM Na2HPO4

12 mM glucose

50 mM HEPES

Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌，分装；

2M CaCl2： 过滤灭菌，分装。

二. 实验过程：

1. 铺细胞： 选择状态良好的293T细胞传代， 2-3x105个细胞/35mm dish。

2. 20-24h后，待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候，进行转染。下面就35mm dish为例，采用以下转染体系：

ddw： 105ul

plasmid： 2 ug （如0.5ug/ul， 即用4ul）

2M CaCl2： 16.5ul

2XHBS： 125ul

按上述顺序，往eppendorf管中依次加入上述四种试剂。

先将前三者混匀， 最后加2XHBS。

一种方法是，加2XHBS时要逐滴加入， 吹打至微现乳白色， 立即均匀滴入培养皿，轻轻摇匀后置于培养箱中，6-8h后换液。

另一种方法是， 加入2XHBS后立即吹打约40下（不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定， 建议做一个梯度实验，吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打）， 之后步骤同上， 立即均匀滴入培养皿，轻轻摇匀后置于培养箱中，6-8h后换液。