外泌体多参数综合表征定量分析在数据质量、灵活性与速度提升的详解
近日，英国Oxford Nanoimaging公司专为外泌体（Exosome）研究量身定制的多参数综合表征定量分析解决方案全新升级，升级后的试剂盒EV Profiler Kit V2可以超分辨率精度量化纳米级小型、稀有和珍贵的外泌体样品，帮助您全面关注外泌体族群问题。EV Profiler Kit V2试剂盒主要优势归纳如下：
01.精准识别和确定外泌体尺寸
国际细胞外囊泡协会发布的MISEV指南概述了蛋白质和非蛋白质标记物在共定位时的组合可以为单颗粒测量的标记提供更大的EV特异性证据。EV Profiler V2试剂盒中含有的Pan-EV染色，是Oxford Nanoimaging公司专门开发的一种基于凝集素、可标记外泌体膜糖蛋白的染料，与针对常见四次跨膜蛋白标志物（CD9、CD63和CD81）的经验证的抗体一起，能精准识别外泌体并确定外泌体群体的大小分布。
图1. Pan-EV 染色标记的HCT116细胞系来源的外泌体图像
图2.Pan-EV染色确定不同外泌体群体的大小
图1显示了用Pan-EV染色（黄色）、抗CD63（青色）和抗CD81（品红色）标记的HCT116细胞系来源的外泌体。图2显示了大小基于四跨膜蛋白（左）或Pan EV信号（右）的两种不同的外泌体群体。
02.在同一样本上检测外泌体物质运输和表面生物标志物
EV Profiler Kit V2试剂盒可以检测和量化单个外泌体水平上的物质运输以及表面生物标志物。同一样本中可检测3个标志物。
图3.ONI Pan-EV 染色HCT116衍生的外泌体
HCT116来源的外泌体用488标记的ONI Pan-EV染料染色，四次跨膜蛋白组合Tetraspanin Trio（anti-CD9, anti-CD63 and anti-CD81）用568共同染色，anti-Syntenin-1用647染色。图3显示了任一或两种标记物阳性的外泌体中四次跨膜蛋白的数量或Syntenin-1计数。
03.评估外泌体形态
单分子定位显微镜与适当的荧光标记探针结合使用，有助于评估纯化后外泌体群体和单个外泌体的完整性和形态。EV Profiler Kit V2试剂盒中的Pan-EV染色结合ONI公司独特的CODI云平台上基于聚类的分析模块，可以报告外泌体的形态特征，如大小和形状等。
04.群体→单个，对外泌体跨尺度特征化
每个EV Profiler Kit V2包含足够的材料，其中的4通道分析芯片已针对外泌体捕获进行了充分地开发和优化，可以分析12个外泌体样本。您可以使用适当的捕获方法从任何给定来源捕获数百个外泌体，并对其进行成像，将单个外泌体放大，还可以查看单个外泌体水平上的生物标志物分布。
图5. 外泌体群体及单个成像
借助Nanoimager和CODI平台可实现外泌体样本的成像和视觉检查。在数千个外泌体种检查其中一个外泌体时，标尺范围从10µm到50 nm不等。图5这些外泌体是用ONI的S4分子捕获的HCT116来源的外泌体样品成像，并用Pan-EV染色（黄色）、anti-CD63-568（青色）和anti-CD81-647（品红色）标记。
05.快速获得结果
EV Profiler V2试剂盒包含用于捕获、固定和染色外泌体所有必要的试剂。然后借助Nanomimager获得单分子定位数据和纳米级分辨率图像，通过CODI平台对这些数据进行分析，在几个小时就可以得到对单个外泌体成像的结果。该工作流程适用于低至10µL的外泌体样本量。
图6. 单个外泌体成像工作流程
06.更大的样品灵活性
EV Profiler V2试剂盒为外泌体捕获提供了3种选择：
（1）基于四次跨膜蛋白的捕获。ONI验证了针对四次跨膜蛋白的捕获抗体：试剂盒中包括抗CD9、抗CD63和抗CD81抗体。
（2）磷脂酰丝氨酸依赖性、蛋白质非依赖性捕获。专有的S4捕获分子可以与蛋白质无关的方式结合外泌体，这对富含磷脂酰丝氨酸的外泌体十分有效。
（3）自定义基于目标的捕获。根据您的目标蛋白来选择相应的抗体——它只需要被生物素化（样本由Nicole Meisner Kober博士的实验室提供）。
图7.EV Profiler V2试剂盒三种捕获方式
在EV Profiler V2试剂盒中，包括标准四次跨膜蛋白标记物（CD9、CD63和CD81）的抗体，其与Tetraspanin Trio使用的相同荧光团组合，使得研究人员能够在需要时使用两个通道来获得自己感兴趣的生物标志物。EV Profiler V2试剂盒是一个模块化试剂盒，您可以将其中的抗体替换为与自己的目标蛋白相对应的抗体。
07.外泌体分析和量化变得更简单
CODI云平台内专门构建的分析工具，可以无缝处理单分子定位数据，获得输出汇总数据的文件，如每个样本的生物标志物阳性率、外泌体尺寸分布、每个外泌体的生物标志物密度（定位/聚类）、外泌体形态参数、从外泌体样本导出高分辨率三色图像等。
图8.CODI云软件上的单分子数据聚类
图8显示了使用EV Profiler Kit V2试剂盒，Nanoimager拍摄的图片。CODI云平台使用单分子数据的聚类，可以帮助评估外泌体形态学特征并确定不同生物标志物的阳性水平。
总的来说，与第一代多参数综合表征定量分析解决方案相比，EV Profiler V2试剂盒在数据质量、灵活性、速度方面都有着巨大的提升。如果您想了解更多，欢迎联系我们。
01.精准识别和确定外泌体尺寸
国际细胞外囊泡协会发布的MISEV指南概述了蛋白质和非蛋白质标记物在共定位时的组合可以为单颗粒测量的标记提供更大的EV特异性证据。EV Profiler V2试剂盒中含有的Pan-EV染色，是Oxford Nanoimaging公司专门开发的一种基于凝集素、可标记外泌体膜糖蛋白的染料，与针对常见四次跨膜蛋白标志物（CD9、CD63和CD81）的经验证的抗体一起，能精准识别外泌体并确定外泌体群体的大小分布。
图1. Pan-EV 染色标记的HCT116细胞系来源的外泌体图像
图2.Pan-EV染色确定不同外泌体群体的大小
图1显示了用Pan-EV染色（黄色）、抗CD63（青色）和抗CD81（品红色）标记的HCT116细胞系来源的外泌体。图2显示了大小基于四跨膜蛋白（左）或Pan EV信号（右）的两种不同的外泌体群体。
02.在同一样本上检测外泌体物质运输和表面生物标志物
EV Profiler Kit V2试剂盒可以检测和量化单个外泌体水平上的物质运输以及表面生物标志物。同一样本中可检测3个标志物。
图3.ONI Pan-EV 染色HCT116衍生的外泌体HCT116来源的外泌体用488标记的ONI Pan-EV染料染色，四次跨膜蛋白组合Tetraspanin Trio（anti-CD9, anti-CD63 and anti-CD81）用568共同染色，anti-Syntenin-1用647染色。图3显示了任一或两种标记物阳性的外泌体中四次跨膜蛋白的数量或Syntenin-1计数。
03.评估外泌体形态
单分子定位显微镜与适当的荧光标记探针结合使用，有助于评估纯化后外泌体群体和单个外泌体的完整性和形态。EV Profiler Kit V2试剂盒中的Pan-EV染色结合ONI公司独特的CODI云平台上基于聚类的分析模块，可以报告外泌体的形态特征，如大小和形状等。
图4.CODI分析模块显示外泌体的大小和形状
图4显示了两个叠加图像的示例，其中A表示较小且较不圆的外泌体，B表示较大且较圆的外泌体。
04.群体→单个，对外泌体跨尺度特征化
每个EV Profiler Kit V2包含足够的材料，其中的4通道分析芯片已针对外泌体捕获进行了充分地开发和优化，可以分析12个外泌体样本。您可以使用适当的捕获方法从任何给定来源捕获数百个外泌体，并对其进行成像，将单个外泌体放大，还可以查看单个外泌体水平上的生物标志物分布。
图5. 外泌体群体及单个成像
借助Nanoimager和CODI平台可实现外泌体样本的成像和视觉检查。在数千个外泌体种检查其中一个外泌体时，标尺范围从10µm到50 nm不等。图5这些外泌体是用ONI的S4分子捕获的HCT116来源的外泌体样品成像，并用Pan-EV染色（黄色）、anti-CD63-568（青色）和anti-CD81-647（品红色）标记。
05.快速获得结果
EV Profiler V2试剂盒包含用于捕获、固定和染色外泌体所有必要的试剂。然后借助Nanomimager获得单分子定位数据和纳米级分辨率图像，通过CODI平台对这些数据进行分析，在几个小时就可以得到对单个外泌体成像的结果。该工作流程适用于低至10µL的外泌体样本量。
图6. 单个外泌体成像工作流程
06.更大的样品灵活性
EV Profiler V2试剂盒为外泌体捕获提供了3种选择：
（1）基于四次跨膜蛋白的捕获。ONI验证了针对四次跨膜蛋白的捕获抗体：试剂盒中包括抗CD9、抗CD63和抗CD81抗体。
（2）磷脂酰丝氨酸依赖性、蛋白质非依赖性捕获。专有的S4捕获分子可以与蛋白质无关的方式结合外泌体，这对富含磷脂酰丝氨酸的外泌体十分有效。
（3）自定义基于目标的捕获。根据您的目标蛋白来选择相应的抗体——它只需要被生物素化（样本由Nicole Meisner Kober博士的实验室提供）。
图7.EV Profiler V2试剂盒三种捕获方式
在EV Profiler V2试剂盒中，包括标准四次跨膜蛋白标记物（CD9、CD63和CD81）的抗体，其与Tetraspanin Trio使用的相同荧光团组合，使得研究人员能够在需要时使用两个通道来获得自己感兴趣的生物标志物。EV Profiler V2试剂盒是一个模块化试剂盒，您可以将其中的抗体替换为与自己的目标蛋白相对应的抗体。
07.外泌体分析和量化变得更简单
CODI云平台内专门构建的分析工具，可以无缝处理单分子定位数据，获得输出汇总数据的文件，如每个样本的生物标志物阳性率、外泌体尺寸分布、每个外泌体的生物标志物密度（定位/聚类）、外泌体形态参数、从外泌体样本导出高分辨率三色图像等。
图8.CODI云软件上的单分子数据聚类
图8显示了使用EV Profiler Kit V2试剂盒，Nanoimager拍摄的图片。CODI云平台使用单分子数据的聚类，可以帮助评估外泌体形态学特征并确定不同生物标志物的阳性水平。
总的来说，与第一代多参数综合表征定量分析解决方案相比，EV Profiler V2试剂盒在数据质量、灵活性、速度方面都有着巨大的提升。如果您想了解更多，欢迎联系我们。
