正常人骨膜内成骨细胞原代培养

正常人骨膜内成骨细胞原代培养

实验材料：

1. 骨组织来源：手术切除之骨组织；

2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2；

3. 消化液：0.25%胰蛋白酶溶液，1mg/mlⅠ型胶原酶溶液；

4. 培养液：RPMI 1640培养基，配制培养液时加入15%的小牛血清，并用5.6% NaHCO3调节至pH 7.2；

实验方法：

1. 取人手术切除之骨膜，放入盛有缓冲液的培养皿中，去除附于骨膜上的结缔组织；

2. 将骨膜剪碎成1—2mm2大小的组织块（膜片）；

3. 加入0.1%EDTA与0.25%胰蛋白酶（1：1，V/V）混合消化液，在37℃下消化20—30min。以1000r/min离心1—2min，沉淀骨膜组织块，除去上清液；

4. 用缓冲液洗沉淀骨膜组织块2—3次，重复上述离心过程；

5. 在37℃下再用1mg/mlⅠ型胶原酶消化骨膜组织块约90min。离心（1000r/min，5—10min）以沉淀细胞，弃去消化液。再用培养液洗1—2次，离心收集细胞；

6. 加培养液于离心管中分散细胞，调成细胞密度1×106—5×106个/ml的悬液。将细胞悬液种植于培养瓶中。也可不使用消化酶而行植块培养法种植培养，培养条件同前；

7. 待细胞长满培养瓶壁后进行传代培养；