正常小梁细胞原代培养

 

实验材料：

1.    材料来源：人眼、兔眼或者猪眼等；

2.    清洗液：不含Ca²⁺和Mg²⁺的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2；

3.    器械：小梁剪与无齿镊等；

4.    消毒液：200IU/ml的庆大霉素生理盐水；

5.    培养液：基础液由DMEM培养基加入HEPES 6.0g/L、NaHCO₃2.2 g/L以及L-谷氨酰胺0.06 g/L配制而成。应用液是在基础液内补加15%的胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml，并用5% NaHCO₃调节pH至7.0—7.2；

6.    培养器皿：培养瓶、24孔培养板或培养皿若干；

 

实验方法：

1.    将离体的供体眼球用200IU/ml的庆大霉素溶液浸泡消毒5min；

2.    无菌条件下，沿角膜缘后5mm处环形剪开眼球，剪断晶状体悬韧带，去除晶状体和玻璃体；

3.    将眼前段倒放在培养皿中，在显微镜下用无齿镊把虹膜抹离角膜内皮面，暴露房角结构。用角膜剪紧贴虹膜与巩膜的附着部位，剪除色素膜；

4.    以PBS溶液或平衡盐溶液轻微冲洗小梁组织表面。用小梁剪伸入Schlemm管，楔形剪取小梁组织。前界至Schwalbe线，后界至巩膜嵴。环形取出一块小梁组织，置于培养皿中；

5.    经PBS漂洗后将小梁组织剪碎，几乎成浆状；

6.    用无齿镊挑起少许小梁组织，接种于24孔培养板后培养瓶皿中，轻轻铺平。待组织稍干后加入适量培养液，在CO₂培养箱静置培养。第四天后开始换液，每周2次；