从力学看再生：PIEZO1如何将组织张力转译为增殖信号
南模生物为该研究提供了Alb-Dre、Ccnd1-RSR-CreERT2基因编辑小鼠模型。
肝脏是哺乳动物体内再生能力最强的实体器官，即便在手术切除三分之二（70%部分肝切除，partial hepatectomy, PHx）后，剩余组织也能在数天内恢复原有质量和功能结构。肝脏小叶内的代谢功能呈高度区域化分布——门静脉周围的zone 1肝细胞主导氧化代谢（如糖异生和脂肪酸氧化），中央静脉周围的zone 3肝细胞专司糖酵解和脂质合成，而位于两者之间的中叶zone 2则逐步被认识为维持肝脏稳态和再生的核心区域，表达胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）、铁调素2（HAMP2）和细胞周期蛋白D1（CCND1）等特征性标志物。
尽管代谢分区（metabolic zonation）的研究已较为深入，一个核心问题始终悬而未决：肝脏如何感知组织损失，并在维持复杂功能结构的同时协调空间上有序的再生反应？损伤后残余肝组织会立即出现肝细胞肥大（hypertrophy）和组织张力增加——这提示物理力可能充当再生的触发信号，但哪一群肝细胞负责感知力学信号并将其转化为增殖指令，此前并不清楚。
1 DPP4⁺肝细胞是具有高度增殖活性的肝脏中叶亚群
为系统鉴定肝脏再生过程中的关键增殖细胞群体，研究团队对人和小鼠再生肝脏的单细胞转录组数据进行了重新分析。结果显示，表达二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase-4, DPP4）的肝细胞亚群展现出高度增殖活性，高表达Ki67、PCNA和CCND1等增殖标志物（图1a, b），并富含IGFBP2和HAMP2等再生相关基因（图1c）。空间转录组分析进一步确认，Dpp4的表达主要富集于肝脏中叶zone 2，并向zone 3适度延伸（图1d）。
为在体内追踪DPP4⁺细胞的命运，研究团队构建了Dpp4-CreERT2敲入小鼠，将其与Rosa26-LSL-GFP报告小鼠交配，实现DPP4⁺细胞的永久荧光标记（图1e, f）。免疫染色确认，GFP标记细胞与内源性DPP4蛋白高度共标（图1h），且GFP⁺细胞的Ki67阳性率显著高于GFP⁻群体（图1i）。空间分布上，GFP⁺细胞主要集中于E-cadherin⁺的zone 1和GS⁺的zone 3之间的中叶区域（图1j）。在长达32周的稳态谱系追踪中，DPP4⁺细胞持续向三个肝区缓慢扩增（图1k），表明其在正常肝脏稳态维持中也发挥一定作用。
图1. Dpp4-CreERT2小鼠标记增殖性肝细胞
2 IL-DPP4⁺肝细胞是PHx后驱动
肝脏再生的主要增殖细胞池为验证DPP4⁺肝细胞在损伤后是否主动驱动肝脏再生，研究团队对Dpp4-CreERT2;R26-LSL-GFP小鼠实施70% PHx，在术后1、2、4、7天进行动态追踪（图2a）。免疫染色显示，DPP4⁺肝细胞首先在zone 2内扩增，随后向zone 1和zone 3迁移以重建整个肝小叶（图2b）。GFP⁺肝细胞的EdU掺入率显著高于GFP⁻群体，标记细胞随时间持续积累（图2d, e）。
为在单细胞分辨率下定量追踪克隆扩增行为，研究团队采用低剂量他莫昔芬诱导的稀疏标记策略，在Dpp4-CreERT2;mT/mG小鼠中进行三维（3D）克隆分析（图2c）。3D重建显示，绝大多数GFP⁺细胞簇呈现成对的相邻肝细胞形态，指示细胞分裂而非多倍体化（图2f, g）。从术后第2天到第4天，含≥2个细胞的克隆簇比例显著上升，至第7天，许多克隆已发展为跨越多个肝区的玫瑰花环样大克隆（图2f, g）。综上，DPP4⁺肝细胞是肝脏再生中高度活跃的增殖细胞池，通过反复分裂驱动肝脏质量的恢复。
图2. DPP4⁺肝细胞是部分肝切除后主要的再生细胞来源
3 中叶DPP4⁺肝细胞在再生中优先肥大并形成力学热点
肝细胞肥大是肝脏质量恢复的早期关键驱动因素。那么DPP4⁺肝细胞是否在损伤后经历了更为显著的肥大？研究团队利用Dpp4-CreERT2;mT/mG小鼠对PHx后的肝细胞大小进行定量分析，发现DPP4⁺肝细胞的面积在PHx后显著增加（图3a）。3D重建进一步揭示，虽然三个肝区的肝细胞在再生过程中均有所增大，但中叶zone 2的肥大反应最为显著（图3b, c）。通过Alb-Dre;Ccnd1-RSR-CreERT2双重组酶交叉策略独立标记zone 2肝细胞（图3d），这一区域性肥大现象得到了独立验证（图3e-g）。
伴随细胞体积增大，zone 2 DPP4⁺肝细胞中磷酸化肌球蛋白轻链2（p-MLC2）水平升高至约3倍，提示皮层张力显著增加（图3h, i）。利用荧光寿命成像显微镜（FLIM）结合力学敏感探针Flipper-TR，研究团队发现PHx后肝细胞膜张力整体升高，且DPP4⁺细胞的膜张力明显高于DPP4⁻邻近细胞（图3j）。通过原子力显微镜（AFM）微流变学测量（图3k），zone 2的组织硬度（弹性模量）从术前的约2.43 kPa升高至术后的约4.53 kPa，几乎翻倍，而zone 1和zone 3未见同等程度的升高（图3l）。
为探究这些物理信号的上游分子基础，研究团队通过激光捕获显微切割分离了zone 2的DPP4⁺肝细胞（图3m）。RT-qPCR分析显示，这些细胞高表达表皮生长因子受体（Egfr）、机械敏感离子通道PIEZO1以及YAP/TAZ和MRTF-SRF信号通路的关键靶基因（图3n）。这些结果共同表明，中叶zone 2在PHx后成为一个生物力学热点区域，DPP4⁺肝细胞作为力学感知亚群，在此整合肥大信号与增殖信号。
图3. 中叶DPP4⁺肝细胞在肝脏再生中表现出优先肥大和增加的膜张力
4 PIEZO1的区域化表达赋予中叶肝细胞力学感知能力
上述发现引出一个关键问题：DPP4⁺肝细胞的区域性力学感知能力的分子基础是什么？研究团队聚焦于PIEZO1——一种在多种组织中充当主要力学传感器的机械敏感离子通道。通过将Piezo1-CreER敲入小鼠与Rosa26-LSL-GFP报告小鼠交配（图4a），在基线状态下标记PIEZO1⁺细胞后进行PHx追踪（图4b）。结果显示，几乎所有GFP⁺细胞均为HNF-4α⁺的多边形肝细胞（图4c），且在空间分布上与DPP4⁺细胞较为一致——主要集中于中叶zone 2，zone 3有中等分布，zone 1则极为稀疏（图4d, e）。
在70% PHx后，PIEZO1⁺细胞群体从初始的zone 2限制性分布向外显著扩增，7天内重新填充了门周区和中央区（图4f, g）。功能上，PIEZO1激动剂Yoda1可引发肝细胞强烈的Ca²⁺内流，该反应严格依赖于PIEZO1的表达（图4h）。值得注意的是，这种力学-化学耦合受底物硬度调控：在高硬度基质上培养的肝细胞中，Yoda1诱导的Ca²⁺内流明显增强（图4i），且底物硬度本身即可在一定程度上促进肝细胞增殖，而Yoda1进一步放大了这种硬度依赖性的增殖反应（图4j, k）。使用PIEZO1抑制剂Dooku1或siRNA沉默PIEZO1均可消除该效应（图4j, k）。这些结果表明，PIEZO1的区域化表达使中叶肝细胞能够感知再生过程中的组织硬度信号，形成一种力学调控的增殖检查点。
图4. PIEZO1的空间限制性表达介导肝脏区域性力学感知
5 PIEZO1是肝脏分区再生所必需的力学传感器
为验证PIEZO1在肝脏再生中的功能必要性，研究团队首先构建了Dpp4-CreERT2;Piezo1flox/flox（Dpp4-Piezo1-KO）小鼠，在DPP4⁺肝细胞中特异性敲除Piezo1后进行70% PHx（图5a）。与同窝对照相比，Dpp4-Piezo1-KO小鼠表现出严重的再生缺陷：肝细胞增殖（BrdU掺入和Ki67染色）显著受抑，zone 2肝细胞扩增明显减弱（图5b, c），克隆分析证实Piezo1缺失的肝细胞无法形成多细胞克隆（图5d），肝脏质量恢复和损伤修复均显著延迟（图5e）。
为排除脱靶效应并将表型精准定位于中叶niche，研究团队利用Alb-Dre;Ccnd1-RSR-CreERT2双重组酶交叉策略，仅在ALB⁺CCND1⁺双阳性的zone 2肝细胞中敲除Piezo1（图5f, g）。该三重突变小鼠完全重现了Dpp4-Cre驱动敲除模型的再生障碍表型（图5h-j）。此外，通过AAV8递送lox-stop-lox-Piezo1 shRNA实现急性敲低（图5k-m），以及使用药理学PIEZO1抑制剂Dooku1处理，同样严重削弱了肝细胞增殖和肝脏再生（图5n-p）。
值得注意的是，肝窦内皮细胞（LSEC）中Piezo1的缺失并不影响再生性增殖，表明PIEZO1的促再生功能是肝细胞内在的。在CCl₄诱导的中央区（zone 3）选择性损伤模型和慢性重复损伤模型中，DPP4⁺肝细胞或zone 2肝细胞中Piezo1的缺失同样导致修复障碍。这些多层次的功能缺失实验共同确认，zone 2肝细胞固有的PIEZO1力转导是驱动肝脏分区再生的核心要素之一。
图5. PIEZO1对肝脏分区再生至关重要
6 PIEZO1功能增强可加速肝脏再生
如果PIEZO1缺失抑制再生，那么增强PIEZO1信号是否足以提升再生能力？研究团队引入了携带R2482H点突变（对应人类PIEZO1功能获得性突变，Arg2482突变为His）的Piezo1功能获得性（gain-of-function, GOF）等位基因——该突变可显著减缓通道失活动力学、增强力学敏感性。通过将Piezo1-GOF小鼠与Dpp4-CreERT2交配（Piezo1-GOFᴰᴾᴾ⁴），在DPP4⁺肝细胞中特异性增强PIEZO1功能（图6a）。
在70% PHx后，Piezo1-GOFᴰᴾᴾ⁴小鼠展现出显著增强的再生能力：肝脏组织结构恢复加速（图6b），肝脏质量恢复更快（图6c），血清转氨酶（ALT和AST）水平恢复更迅速（图6d），EdU和Ki67阳性肝细胞数量和染色强度均显著升高（图6e）。机制上，再生过程中IGFBP2的表达在Piezo1-GOFᴰᴾᴾ⁴肝细胞中显著上调（图6f）。
在CCl₄诱导的急性中央区损伤模型中，Piezo1-GOFᴰᴾᴾ⁴小鼠同样表现出明显的再生优势，IGFBP2上调并加速坏死区域的补充恢复（图6g-i）。更为关键的是，通过Alb-Dre;Ccnd1-RSR-CreERT2系统将PIEZO1功能增强精确限制在zone 2肝细胞中（图6j），即可在PHx和CCl₄两种模型中驱动增强的增殖和修复加速，同时上调中叶IGFBP2表达（图6k-n）。这些结果揭示，PIEZO1介导的力转导是调控中叶肝细胞再生能力的重要分子开关，增强这一信号足以加速组织修复。
图6. 肝脏PIEZO1功能增强促进肝脏再生
此研究从力学感知的视角，揭示了肝脏再生的空间调控机制：在PHx后，中叶zone 2成为生物力学热点区域——该区域的DPP4⁺肝细胞经历最大程度的肥大、皮层张力和组织硬度升高，同时这些细胞高表达机械敏感离子通道PIEZO1，使它们能够将物理力学信号转化为钙内流，经NFATC3转录因子激活下游效应因子IGFBP2的表达，驱动分区有序的增殖程序。研究团队还发现，YAP/TAZ信号通路部分依赖于PIEZO1介导的力转导参与这一过程。PIEZO1功能缺失严重损害肝脏再生，而增强PIEZO1信号则加速组织修复——这一力学转导轴的发现为理解肝脏再生的空间协调性提供了新的思路，也提示PIEZO1-IGFBP2轴可能作为慢性肝病治疗中促进肝脏修复的潜在干预方向之一。
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上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。
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