雌激素重编程STING信号驱动NETs屏蔽肿瘤抗原的研究

图1. 配对的“类II期”PDX临床前试验揭示对CLDN18.2-ADC的性别二态性响应

2雌激素而非雄激素驱动对CLDN18.2-ADC的性别二态性耐药
性激素在雌雄之间存在明显差异，并可塑造宿主微环境。在交叉性别移植实验中，研究团队观察到宿主性别而非供体肿瘤性别决定治疗响应的差异，据此进一步考察雌激素或雄激素的作用。研究团队在肿瘤移植前14天切除成年小鼠的性腺并检测外周血激素水平（图2A、2B），随后在荷瘤后给予CLDN18.2-ADC（图2C）。结果显示，雄性小鼠去势（orchiectomy，ORX）对ADC疗效影响很小，去势与假手术雄性小鼠中均可见明显的肿瘤退缩（图2D、2E）、凋亡增加（图2F）与生存延长（图2G）；与之相反，卵巢切除（ovariectomy，OVX）雌性小鼠对ADC的敏感性明显提高，肿瘤体积显著减小、肿瘤抑制率升高（图2H、2I）、凋亡增加（图2J）、生存改善（图2K），提示雌激素是CLDN18.2-ADC耐药的重要介导因素。

为明确17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）这一雌激素主要生物活性形式的作用，研究团队在OVX雌性小鼠肿瘤移植前2周皮下植入E2缓释胶囊（图2L），并通过血清E2定量确认激素水平得到恢复（图2M）。E2回补在OVX小鼠中重新建立了对CLDN18.2-ADC的治疗耐药，表现为肿瘤持续生长（图2N–2S）、凋亡减少（图2T）以及生存获益降低（图2U）。这些结果表明，是雌激素而非雄激素主导了CLDN18.2靶向ADC治疗的性别二态性响应。
 

图2. 雌激素而非雄激素驱动对CLDN18.2-ADC的性别二态性耐药

3雌激素诱导中性粒细胞依赖的CLDN18.2-ADC耐药
为解析雌激素诱导性别二态性的机制，研究团队首先考察了雌激素对肿瘤细胞的直接影响，发现雌激素既不改变CLDN18.2的表达，也不影响肿瘤细胞的内化过程，提示其驱动的耐药可能来自肿瘤细胞之外。考虑到免疫微环境对ADC疗效的影响，研究团队对Sham与OVX雌性小鼠KPC类器官荷瘤模型的CD45+免疫细胞进行了单细胞RNA测序（图3A），共获得41,260个高质量转录组，聚类为7个主要免疫谱系，包括T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞和B细胞（图3B、3C）。雌激素去除后，T细胞与中性粒细胞的丰度发生变化（图3D）。鉴于在T细胞缺陷模型中性别二态性响应依然可见，研究团队将关注点转向中性粒细胞，其丰度在雌激素去除后明显下降（图3E、3F）；流式分析验证了卵巢切除后中性粒细胞丰度的显著降低（图3G、3H），而E2回补可恢复OVX小鼠瘤内中性粒细胞的聚集（图3I–3K）。

为考察中性粒细胞的因果作用，研究团队采用抗Ly6G抗体在荷瘤小鼠中清除中性粒细胞（图3L、3M），清除后CLDN18.2-ADC的疗效显著恢复，表现为肿瘤重量降低（图3N）、凋亡增加（图3O）和生存延长（图3P）。研究团队还将骨髓来源中性粒细胞（bone marrow-derived neutrophils，BM.Neu）过继转移至中性粒细胞谱系被遗传学去除的S100a8-DTA雌性小鼠（图3Q），转移明显削弱了ADC在雌性小鼠中的疗效，表现为肿瘤负荷升高（图3R、3S）、凋亡减少（图3U）、Ki67阳性细胞增多（图3V、3W）以及生存缩短（图3X）。这些结果提示，雌激素是通过改变中性粒细胞的功能状态来诱导ADC耐药，而非仅改变其数量。
 

图3. 雌激素诱导中性粒细胞依赖的CLDN18.2-ADC耐药

4雌激素诱导的NET形成限制肿瘤抗原可及性并削弱ADC细胞毒性
研究团队进而分析中性粒细胞的功能状态。对Sham与OVX雌性小鼠瘤内中性粒细胞的RNA测序分析显示，氧化应激与脱颗粒相关基因的表达出现改变（图4A）。来自Sham小鼠的中性粒细胞表现出衰老相关表型，其活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平明显高于OVX小鼠（图4B、4C）。由于ROS升高是NET形成的已知驱动因素，研究团队进一步检测NETosis，发现Sham小鼠中发生NETosis的中性粒细胞比例高于OVX小鼠（图4D–4F）。

中性粒细胞胞外陷阱（NETs）由解聚的染色质、组蛋白和颗粒蛋白组成，可包裹肿瘤细胞，但其是否参与ADC耐药尚不清楚。研究团队据此提出假设：NETs可能限制ADC接近肿瘤细胞表面抗原。为验证这一假设，研究团队将CLDN18.2+肿瘤细胞与中性粒细胞在雌激素刺激下共培养（图4G）。扫描电镜显示，雌激素处理后大量NET结构覆盖于肿瘤细胞表面（图4H）；免疫金电镜进一步显示，NET覆盖的肿瘤细胞中ADC的积聚减少，提示ADC的进入与内化受到限制。研究团队将这一过程定义为“NET介导的功能性抗原屏蔽”（图4P）。

在共培养体系中加入CLDN18.2-ADC后，雌激素刺激下被NET覆盖的肿瘤细胞所受的细胞毒性降低（图4I、4J）。为直接观察NETs对ADC可及性的影响，研究团队制备了ATTO647标记的CLDN18.2-ADC用于体外与体内示踪（图4K）。共培养中，雌激素诱导的NET形成明显减少了ADC与肿瘤细胞表面的结合，标记的ADC更多滞留于NET结构内（图4L）；体内成像显示，雌性Sham小鼠中ADC向肿瘤细胞的定位受损，而OVX小鼠中雌激素的去除恢复了ADC与肿瘤细胞抗原的结合（图4M–4O）。

为确定NETs是否为ADC耐药所必需，研究团队通过遗传学方法降低NET形成，构建了中性粒细胞谱系Padi4敲除小鼠（S100a8-Padi4Δ）（图4Q）。与野生型相比，S100a8-Padi4Δ雌性小鼠的NET形成明显减少（图4R、4S），对CLDN18.2-ADC治疗的响应改善，表现为肿瘤细胞凋亡增加（图4T）、肿瘤负荷降低（图4U、4V）和生存延长（图4W）。这些结果表明，NET形成是性别偏倚ADC耐药的功能性必需环节，抑制其形成可恢复对ADC治疗的敏感性。
 

图4. 雌激素诱导的NET形成限制肿瘤抗原可及性并削弱ADC细胞毒性

5雌激素将肿瘤细胞STING信号重定向至NF-κB以促进NET形成
为探究雌激素如何驱动NET在肿瘤微环境中积累，研究团队首先考察了其对中性粒细胞的直接影响。虽然雌激素在体外可经GPER1诱导离体中性粒细胞发生NETosis，但在相同雌激素条件下，肿瘤细胞与中性粒细胞共培养所诱导的NET形成多于中性粒细胞单独培养（图5A–5C）；且雌激素处理的CLDN18.2+肿瘤细胞条件培养基比CLDN18.2−细胞条件培养基诱导更强的NET形成（图5D–5F），提示存在依赖CLDN18.2的肿瘤细胞程序。

转录组分析显示，CLDN18.2过表达细胞中I型干扰素通路富集、干扰素刺激基因广泛上调，并伴有STING磷酸化增加。药理抑制STING（SN-011）（图5G）可抑制由雌激素处理的CLDN18.2+肿瘤细胞所诱导的NET形成（图5H）与中性粒细胞迁移（图5I）；在正交移植的KPC类器官中敲除STING同样明显减弱体内雌激素诱导的NET形成（图5J–5L）。这些结果提示，肿瘤细胞STING信号是雌激素诱导NET形成的重要介导因素。

STING激活通过IRF3与NF-κB两条信号轴传导（图5M）。为区分哪条输出对NET形成是必需的，研究团队检测了雌激素处理后STING效应通路的激活情况，发现雌激素抑制CLDN18.2+肿瘤细胞中IRF3相关的干扰素响应，同时增强NF-κB的激活（图5N、5O）。抑制NF-κB而非TBK1/IRF3可抑制由雌激素处理的肿瘤细胞所诱导的NET形成（图5P–5T），并减少雌性小鼠瘤内的NET积累（图5U、5V）。这些结果表明，雌激素使CLDN18.2+肿瘤细胞中的STING信号偏向NF-κB主导，从而促进NET形成和治疗耐药。
 

图5. 雌激素将肿瘤细胞STING信号重定向至NF-κB以促进NET形成

6 雌激素重编程肿瘤细胞分泌的CXCL1促进CXCR2依赖的NET形成
为鉴定负责中性粒细胞募集与NET形成的肿瘤来源因子，研究团队分析了雌激素处理的CLDN18.2+肿瘤细胞的分泌组（图6A）。用3 kDa截留滤膜对条件培养基进行分离后发现，富蛋白组分而非富代谢物组分可促进中性粒细胞趋化（图6B）与NET形成（图6C）；热变性处理后上述效应消失（图6D、6E），表明起作用的是一类蛋白介质。将分泌组蛋白质组学分析与NF-κB靶基因分析整合，研究团队鉴定出8个候选介质（图6F、6G），其中CXCL1因是公认的中性粒细胞趋化因子而被优先关注。

雌激素明显增加CLDN18.2+肿瘤细胞中CXCL1的分泌（图6H），而中和CXCL1可减少由雌激素处理肿瘤细胞条件培养基诱导的中性粒细胞迁移（图6I）、NET形成（图6J）与ROS产生（图6K）；抑制NF-κB信号则可抑制CXCL1的分泌（图6L），支持CXCL1是STING-NF-κB重编程的下游效应因子。

进一步分析显示，血清CXCL1在雌性KPC类器官荷瘤小鼠和PDAC患者样本中较雄性上调，在女性CLDN18.2+ PDAC患者中尤为明显（图6M、6N）；肿瘤CXCL1水平与瘤内中性粒细胞浸润呈正相关（图6O）；多重免疫荧光显示，女性CLDN18.2+ PDAC患者中NET形成增加、CXCL1水平升高（图6P）。在类器官-中性粒细胞共培养体系中，CXCL1中和抗体增强了ADC的肿瘤杀伤作用（图6Q、6R）；在体内，CXCL1中和明显减少NET形成（图6T），并使雌性荷瘤小鼠对ADC更敏感，表现为肿瘤重量降低（图6U）、凋亡增加（图6V）与生存延长（图6W）。中性粒细胞谱系CXCR2敲除小鼠（S100a8-Cxcr2Δ）（图6X）在雌性宿主中的NET形成明显减少（图6Y），由此确立CXCL1-CXCR2轴是雌激素驱动NET诱导的重要介导通路。
 

图6. 雌激素重编程肿瘤细胞分泌的CXCL1促进CXCR2依赖的NET形成

7 西维来司他抑制NET可增强胰腺癌与胃癌模型中CLDN18.2-ADC的疗效
鉴于NETs在雌性肿瘤中参与介导CLDN18.2-ADC耐药，研究团队推测抑制NET可恢复ADC疗效。西维来司他（sivelestat）是一种选择性中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，可抑制NET形成，并已有临床安全性数据支持，研究团队据此将其与CLDN18.2-ADC联合评估。体外实验显示，西维来司他可抑制雌激素介导的NET形成（图7A、7B）；共培养实验进一步显示，在存在中性粒细胞与雌激素的条件下，西维来司他增强了CLDN18.2-ADC对CLDN18.2+肿瘤细胞的细胞毒性（图7C、7D）。

为评估抑制NET能否在体内恢复ADC疗效，研究团队对雌性KPC小鼠给予皮下西维来司他联合静脉CLDN18.2-ADC治疗（图7E）。西维来司他明显减少瘤内NET形成（图7G、7H）、恢复ADC对肿瘤细胞表面CLDN18.2的可及性（图7J）、增强肿瘤细胞凋亡（图7I）并降低肿瘤增殖（图7K、7L），且不影响体重（图7F）；与单药相比，联合治疗组出现肿瘤退缩（图7M）和生存延长（图7N）。该联合方案的疗效在胃癌模型中同样得到验证（图7O–7S）。这些结果支持，西维来司他可增强CLDN18.2靶向ADC在胰腺癌与胃癌模型中的抗肿瘤活性。
 

图7. 西维来司他介导的NET抑制增强胰腺癌与胃癌模型中CLDN18.2-ADC的疗效

此研究通过“类II期”临床前PDX试验结合多种体内外模型，观察到CLDN18.2靶向ADC疗效的性别二态性：在抗原表达水平相当的情况下，雌性宿主的治疗响应相对减弱。机制上，雌激素经肿瘤细胞膜受体GPER1上调TRAF6的表达，使肿瘤内在的STING信号由IRF3-干扰素轴转向NF-κB轴，驱动CXCL1分泌、中性粒细胞募集与NET形成；NETs随后在肿瘤细胞表面构筑“功能性抗原屏蔽”，限制抗体与细胞表面抗原的结合，从而在抗原表达之外削弱ADC的杀伤作用。针对这一机制，使用西维来司他抑制NET可恢复雌性小鼠的ADC疗效；这些发现为理解抗体类药物的性别偏倚耐药提供了机制线索，也提示将性别因素纳入ADC临床研究设计与治疗策略的意义。

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