红绿灯信号系统介导的多重CRISPR诊断技术

多重核酸检测技术是指在同一管反应中同时进行多个核酸靶标扩增与检测的技术，该技术具有可同时检测多个靶标、在提高检测通量的同时简化操作方法，且能降低检测成本，满足病原微生物鉴定、肉源成分溯源、转基因成分分析等检测需求。近年来，华中农业大学动物遗传育种团队围绕CRISPR/Cas系统，分别开发了荧光增强型核酸可视化检测以及直接裸眼核酸可视化检测技术（RAVI-CRISPR）。然而，如何实现现场多重核酸可视化检测依然是一个难题。

近日，该研究团队在已有工作基础上，建立了一种新的多重RAVI-CRISPR核酸荧光可视化检测技术。该项工作主要亮点在于，研究人员针对多达28对不同荧光基团修饰的单链DNA荧光-淬灭报告基因（ssDNA-FQ）两两组合，利用Exo I核酸外切酶进行切割实验，筛选到能用于Cas12a和Cas13a多重核酸荧光可视化检测的最佳报告基因组合。非常有趣的是，通过比较反应溶液荧光颜色变化特征，发现ROX和JOE修饰的报告基因两两组合时，当报告基因单独或组合存在时，被切割降解后会引起反应溶液颜色发生“红－绿－黄”变化，类似于交通信号灯的颜色转变，色差明显，非常适合用于针对多重核酸靶标裸眼可视化检测。 进一步，该研究团队利用新开发的多重RAVI-CRISPR技术，分别建立了非洲猪瘟病毒、CD163基因敲除和乳铁蛋白基因敲入猪多重核酸检测方法，结果显示，该技术可以达到10^1拷贝/微升的检测灵敏度性，并且检测结果与传统PCR完全一致。该技术最大优势在于仅需小型便携式恒温仪和荧光检测装置即可开展现场核酸多重检测。未来若结合微流控芯片技术，其在畜禽病原核酸现场可视化检测方面将具有非常广阔的应用前景。

该项研究成果于2023年7月11日以题为“Development of a Naked Eye CRISPR-Cas12a and Cas13a Multiplex Point-of-Care Detection of Genetically Modified Swine”发表于国际期刊ACS Synthetic Biology。华中农业大学动科动医学院硕士研究生王缘和付兰婷为该论文的共同第一作者，华中农业大学谢胜松教授、李长春教授、阮进学副研究员为论文共同通讯作者。该研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金委创新研究群体基金、湖北省洪山实验室重大项目等项目资助。