HCPure多模式配体层析——高效去除抗体药物生产中HCPs 和其他杂质

自1986年第一个单克隆抗体（mAb）药物上市以来，全球已有超过100种单抗药物获得了FDA批准。经过30多年的研究和发展，单抗药物以其高度特异性和疗效确切的特点，已被用于多种疾病，包括肿瘤、风湿病、血液和感染性疾病等。随着全球人口老龄化日益加重、慢性病越来越普遍，单抗药物及过程开发变得越来越必要。

 

单克隆抗体（mAb）由中国仓鼠卵巢细胞（CHO），E. coli和HEK等多种不同类型的细胞表达。然而，除了所需的单抗外，这些宿主细胞还会产生其他蛋白质，称为宿主细胞蛋白质(HCP)，这些蛋白质可能会引起治疗效果的改变和患者的免疫原性反应，因此必须在下游纯化过程与其他杂质一起去除。

 

抗体纯化过程通常用Protein A亲和层析进行初纯，然后通过多个离子交换和疏水相互作用层析进一步纯化来自Protein A纯化后的洗脱物。这些纯化步骤可以从上游杂质中纯化目标抗体，包括去除宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞DNA、Protein A渗滤液、内毒素、高分子量聚集物和抗体片段。

 

阴离子交换层析 (Anion exchange chromatography, AIEX) 一般在Protein A 亲和纯化后用来去除HCP和其他杂质。由于蛋白质结合所需的条件和Protein A洗脱液的典型高电导性，溶液需要稀释后才能进行IEX，从而需要大容量的储液罐。离子交换层析通常只会去除 HCP，而不会去除高分子量(HMW)的聚集体，所以还需要疏水相互作用色谱(HIC)的额外纯化步骤来去除HMW聚集体。与Protein A洗脱一样，HIC步骤需要使用高浓度盐，如硫酸铵，会导致目标产物的沉淀，同时也可能导致总回收率降低。

由于表达系统和上游工艺参数的不同，HCP杂质的分布可能会发生显著变化，这使得将HCP去除达到监管机构要求的水平尤其具有挑战性。

HCPure

主要特点：

•对HCP具有高度特异性

•优异的流动性能

•耐用，寿命长，可用NaOH消毒，多次循环使用

•高纯度，化学合成的配基

•高批次间一致性

•全面的监管支持文件

 

优势：

•无需离子交换，减少工艺步骤，提高时间效率

•无需在Protein A捕获步骤后稀释盐浓度

•稳健的的纯化平台，可以根据目标分析物和上游流程的变化进行调整，而无需重新验证工艺

•耐用，易于包装的PuraBead®P6HF基础基质

•衍生的90µm PuraBead P6HF将高流速和高选择性配体密度相结合，以最短的停留时间实现高度纯化

•在pH 2.0到pH 14.0的非常宽的pH范围内稳定

 

HCPure™在CHO细胞中表达的IgG原料中 HCP去除的性能

1、在2.5cm柱高的1ml预装柱中使用HCPure™通过流穿的方式纯化Protein A

2.CHO原料中聚集体的挑战日益增加

初级捕获后，样品用CIEX纯化，然后在低pH和高盐条件下导致出现聚集体。将样品通过HCPure™，由此产生的单抗聚合物减少了近60%

 

HCPure™在HEK中表达的AAV原料中 HCP去除的性能

AAV2流穿组分的再纯化

在使用市售的泛血清型配体进行亲和捕获后，瞬时转染HEK 293细胞的AAV 2含有一些杂质。

洗脱池的pH为7.2,NaCl为350mM，负载为5x1013 VP，以流穿模式通过HCPure™在10mm直径，10cm柱床高的SNAP柱。ELISA法检测AAV2 100%，低pH高盐条带中检出0.9%

 

HCPure™在E.coli中表达的Vκ原料中 HCP去除的性能

1、大肠杆菌原料结合条件的优化

在50 mM Tris-citrate缓冲液中结合。使用6、12和18 mS/cm的电导率，洗脱pH值在pH 6.0和pH 8.0之间变化。

低pH和低电导率条件下HCP的还原率最高

HCPure™在大肠杆菌生产的Vκ原料中筛选结果。在不同的pH值和电导率范围内，对96个井板进行了条件筛选。结果显示HCP的减少，见热图。

 

2、HCP清除率和目标产量的优化条件展示

使用HCPure™时，HCP浓度降低了2-log以上，从负载的30,000 ppm以上降低到非结合部分的约200 ppm。非结合部分的Vκ恢复率大于80%，表明目标Vκ的结合几乎没有损失。

Astrea Bioseparations的HCPure™是一种混合模式吸附剂，可以在各种不同的原料中有效地进行纯化。对于生产单克隆抗体的客户，HCPure™已被证明可以减少包括CHO和大肠杆菌在内的各种原料中的HCP, HCDNA和聚集体。对于细胞和基因治疗的客户，HCPure™也已被证明可以去除HCP，同时在HEK原料中实现AAV的高产量。这种从各种原料中获得高纯度最终产品的能力，使HCPure™成为适应性强的基础纯化平台。