小鼠肠上皮淋巴细胞的分离、鉴定及体外培养
肠道免疫简介 肠道是我们熟知的重要消化器官，主要执行消化、吸收、排毒功能，事实上肠道也是机体最大的免疫器官，还具有免疫防卫和神经调节功能。那么肠道是如何执行免疫功能的呢？首先，我们要知道肠道的免疫功能是由黏膜免疫系统执行的。黏膜免疫系统与外部世界密切接触，包括微生物群、病原体和环境抗原，这需要对免疫反应进行微调，使对病原体的有效反应，同时保持对无害刺激的耐受性。粘膜免疫系统有机体70%以上的免疫细胞，如巨噬细胞、T细胞、NK细胞、B细胞等，集中在肠道，有70%以上的免疫球蛋白A，由肠道制造，用来保护肠道。
图1 小鼠肠黏膜免疫系统构成
粘膜肠上皮细胞由单层肠道上皮细胞组成，它们对营养吸收至关重要，并为有害物质提供屏障。在粘膜单层柱状上皮细胞之间、粘膜上皮细胞的基底膜上，存在着上皮淋巴细胞（Intestinal intraepithelial lymphocyte, IEL）。平均每100个肠上皮细胞之间就有10-20个IEL,80%以上的IEL为CD8+T淋巴细胞；IEL能以非MHC限制的方式直接识别未加工的抗原并发挥溶细胞活性，是机体早期抗感染的重要方式。
IEL可以根据TCR受体的表达谱分为以下几类：TCRab、TCRgd、TCR-,具体分类见下图：
（1）脱颈处死小鼠，喷适量酒精于腹部，开腹暴露肠道。（2）滴适量 Buffer 1（5% RPMI1640 + 5% FBS + 10 mM HEPES）润湿腹腔，将肠道整体向上推翻，找到直肠。由直肠至胃，自下而上分离肠管和系膜等结缔组织。剪取胃下至回盲部上端的小肠，两次对折浸入 5 mL Buffer1中。（3）小肠放入培养皿内并等分。在 Buffer 1 润湿的擦拭布上除去脂肪和淋巴结并剖开。在含有Buffer 1的培养皿中依次清洗小肠，清洗干净后将小肠剪成 1 cm 片段浸入25 mL Buffer 1中。（4） 取材全部结束后，每管加入 1 mM DTT，摇床 37℃，200 rmp，消化 20 min。（5）消化结束后再次离心，4℃，600 rmp，瞬离 30 s。其目的是使未消化彻底的组织沉淀在底部，保证过滤顺畅。离心结束后用 100 μm 滤网并收集上清。（6）剩余组织每管加入 25 mL Buffer 2（ RPMI1640+25 mM EDTA+ 20 mM HEPES）继续消化。摇床 37℃，200 rmp，30 min。（7）第二次消化结束后先用涡旋仪剧烈地漩涡两次，再次离心，4℃ 600 rmp，30 s。（8）收集两次消化获得的上清混匀并进行 4℃离心，2000 rmp，4 min。（9）每管加入10 mL 44%的分离液，离心，2000 rmp，20 min升6降0。（10）收集底部沉淀并加入 25 mL Buffer 1 洗一遍，4℃，1500 rmp，5 min，弃上清。此时获得的细胞即为我们所需的肠上皮淋巴细胞。
图3 小鼠回肠解剖方法展示
小鼠肠上皮淋巴细胞纯度及亚群鉴定
图 4 小鼠肠上皮淋巴细胞分离后细胞纯度及活性鉴定
上文我们已经展示了小鼠肠上皮淋巴细胞IEL的分类，下面我们用流式细胞术详细展示各亚群的圈门策略。小鼠小肠中提到的IEL亚群一般为TCRγδ+ CD4-CD8αα+ (TCRγδCD8αα), TCRαβ+CD4-CD8αα+ (TCRαβ CD8αα), TCRαβ+ CD4-CD8αβ+(TCRαβ CD8αβ), TCRαβ+ CD4+CD8α-(TCRαβ CD4) 和 TCRαβ+ CD4+CD8αα+ (TCRαβ DP). TCRαβ CD8αβ 和TCRαβ CD4 IEL通常被认为是组驻留记忆T细胞，在抗原暴露后会迁移到上皮细胞，相反，前两种亚型通常被认为是非传统的或者先天T细胞，它们直接从胸腺迁移到肠上皮或者经历选择性原位扩张后，组成性地填充肠上皮。
图 5 小鼠肠上皮淋巴各亚群细胞圈门策略
小鼠肠上皮淋巴细胞的体外培养
IEL单独体外培养很容易死亡，IL-15可以短期内维持其活性，而IL-15/IL-15R复合体更加有效。如果需要长期培养，则需要在有多种细胞因子的情况下进行TCR刺激。
短期培养：
细胞铺板，106细胞重悬于96孔板中，并加入20 ng/mL的小鼠IL-15/IL-15R复合物重组蛋白使其终体系为200μL。37 ℃二氧化碳培养箱中可维持1-3天。
长期培养：（1）取anti-mouse CD3ε, clone 145-2C11置于96孔圆底板上(1μg/mL，每孔50μL）， 37℃ 孵育2小时或4℃ 过夜包被。然后用无菌PBS洗涤3次。（2）将IEL以5×105/ml重新悬浮96孔板中，并加入以下细胞因子：IL-2（10 IU/mL）、IL-3（100 IU/mL）、IL-4（100 IU/mL），IL-3（100 IU/mL），IL-4（100 IU/mL），和可溶性的IL-15（100 ng/mL）。（3）200μL体系,37 ℃二氧化碳培养箱中培养48h。（4）洗涤细胞两次，1×105每孔重悬于含IL-2（10 IU/mL）的培养基中。（5）每隔3-4天更换新鲜的含IL-2的培养基。
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图1 小鼠肠黏膜免疫系统构成
粘膜肠上皮细胞由单层肠道上皮细胞组成，它们对营养吸收至关重要，并为有害物质提供屏障。在粘膜单层柱状上皮细胞之间、粘膜上皮细胞的基底膜上，存在着上皮淋巴细胞（Intestinal intraepithelial lymphocyte, IEL）。平均每100个肠上皮细胞之间就有10-20个IEL,80%以上的IEL为CD8+T淋巴细胞；IEL能以非MHC限制的方式直接识别未加工的抗原并发挥溶细胞活性，是机体早期抗感染的重要方式。
IEL可以根据TCR受体的表达谱分为以下几类：TCRab、TCRgd、TCR-,具体分类见下图：
（1）脱颈处死小鼠，喷适量酒精于腹部，开腹暴露肠道。（2）滴适量 Buffer 1（5% RPMI1640 + 5% FBS + 10 mM HEPES）润湿腹腔，将肠道整体向上推翻，找到直肠。由直肠至胃，自下而上分离肠管和系膜等结缔组织。剪取胃下至回盲部上端的小肠，两次对折浸入 5 mL Buffer1中。（3）小肠放入培养皿内并等分。在 Buffer 1 润湿的擦拭布上除去脂肪和淋巴结并剖开。在含有Buffer 1的培养皿中依次清洗小肠，清洗干净后将小肠剪成 1 cm 片段浸入25 mL Buffer 1中。（4） 取材全部结束后，每管加入 1 mM DTT，摇床 37℃，200 rmp，消化 20 min。（5）消化结束后再次离心，4℃，600 rmp，瞬离 30 s。其目的是使未消化彻底的组织沉淀在底部，保证过滤顺畅。离心结束后用 100 μm 滤网并收集上清。（6）剩余组织每管加入 25 mL Buffer 2（ RPMI1640+25 mM EDTA+ 20 mM HEPES）继续消化。摇床 37℃，200 rmp，30 min。（7）第二次消化结束后先用涡旋仪剧烈地漩涡两次，再次离心，4℃ 600 rmp，30 s。（8）收集两次消化获得的上清混匀并进行 4℃离心，2000 rmp，4 min。（9）每管加入10 mL 44%的分离液，离心，2000 rmp，20 min升6降0。（10）收集底部沉淀并加入 25 mL Buffer 1 洗一遍，4℃，1500 rmp，5 min，弃上清。此时获得的细胞即为我们所需的肠上皮淋巴细胞。
图3 小鼠回肠解剖方法展示
小鼠肠上皮淋巴细胞纯度及亚群鉴定
图 4 小鼠肠上皮淋巴细胞分离后细胞纯度及活性鉴定
上文我们已经展示了小鼠肠上皮淋巴细胞IEL的分类，下面我们用流式细胞术详细展示各亚群的圈门策略。小鼠小肠中提到的IEL亚群一般为TCRγδ+ CD4-CD8αα+ (TCRγδCD8αα), TCRαβ+CD4-CD8αα+ (TCRαβ CD8αα), TCRαβ+ CD4-CD8αβ+(TCRαβ CD8αβ), TCRαβ+ CD4+CD8α-(TCRαβ CD4) 和 TCRαβ+ CD4+CD8αα+ (TCRαβ DP). TCRαβ CD8αβ 和TCRαβ CD4 IEL通常被认为是组驻留记忆T细胞，在抗原暴露后会迁移到上皮细胞，相反，前两种亚型通常被认为是非传统的或者先天T细胞，它们直接从胸腺迁移到肠上皮或者经历选择性原位扩张后，组成性地填充肠上皮。
图 5 小鼠肠上皮淋巴各亚群细胞圈门策略
小鼠肠上皮淋巴细胞的体外培养
IEL单独体外培养很容易死亡，IL-15可以短期内维持其活性，而IL-15/IL-15R复合体更加有效。如果需要长期培养，则需要在有多种细胞因子的情况下进行TCR刺激。
短期培养：
细胞铺板，106细胞重悬于96孔板中，并加入20 ng/mL的小鼠IL-15/IL-15R复合物重组蛋白使其终体系为200μL。37 ℃二氧化碳培养箱中可维持1-3天。
长期培养：（1）取anti-mouse CD3ε, clone 145-2C11置于96孔圆底板上(1μg/mL，每孔50μL）， 37℃ 孵育2小时或4℃ 过夜包被。然后用无菌PBS洗涤3次。（2）将IEL以5×105/ml重新悬浮96孔板中，并加入以下细胞因子：IL-2（10 IU/mL）、IL-3（100 IU/mL）、IL-4（100 IU/mL），IL-3（100 IU/mL），IL-4（100 IU/mL），和可溶性的IL-15（100 ng/mL）。（3）200μL体系,37 ℃二氧化碳培养箱中培养48h。（4）洗涤细胞两次，1×105每孔重悬于含IL-2（10 IU/mL）的培养基中。（5）每隔3-4天更换新鲜的含IL-2的培养基。
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