生物保存：冷冻冷藏持续物理、生化和分子反应对样本质量的影响
执行摘要
简介
冰冻的物理影响
细胞持续脱水，直到温度降低到玻璃转换温度(Tg)以下，即样本转变为玻璃态（纯水的Tg 约为-135 °C） 8。
冰冻的分子影响
除了冷冻对样本产生的物理影响，在分子层级上也会产生影响，这是由如下几个因素造成的： 1)可用能量和代谢活动的减少； 2)生化途径的解偶联； 3)应激反应途径的激活9,10。在储存过程中，在降低的动能水平下（降低 10 °C 相当于可用热能降低 3 %），温度的降低会导致新陈代谢和生化途径的减慢1。对于哺乳动物细胞，一个衡量新陈代谢总变化量平均值的简单方法是 Q10，温度每下降 10 °C（Q10为 2），新陈代谢（耗氧量）减少大约 50%11,12。
参考资料
在生物应用中，一个广泛讨论的话题是样本冷冻过程和最终保存和储存温度对生物样本稳定性的影响。为了将生物材料保存在其最佳状态，必须采用慢速冷冻过程，并将储存温度控制在绝对最低值。这些指南已得到普遍认可，但这一过程背后的原理却鲜少有人详细阐述。本白皮书的目的是为这些操作的科学依据及其对生物材料生存能力的影响提供背景资料。
简介
样本储存过程通常被称为生物保存，由四个阶段组成：制备、冷却、储存和解冻。这些阶段通过“被称为低温连续介质的细胞所经历的深化低温应激之旅”紧密相连，其中在一个阶段中发生的事件会影响上下游的相邻阶段 1。生物保存的最终目的是将样本置于生命暂停状态，使其能够在功能齐全的条件下恢复。这一过程对包括细胞、组织、细菌、病毒和分离的亚细胞成分（细胞器、DNA、 RNA、蛋白质）在内的各种样本类型都非常有效，但也可能会产生一些负面影响。可分为两类： 1) 物化-渗透压和 2) 生化/分子2,3。最终，如果下游分析显示样本质量下降，则在解冻后可以观察到这些作用产生的结果。在细胞或组织样本中，这被视为产率或生存能力、功能、繁殖能力的降低以及迟发性凋亡和坏死诱导。在细菌、病毒、亚细胞器、 DNA、 RNA 或蛋白质样本中，数量、质量、纯度等的下降往往是次最优生物保存的结果。
冰冻的物理影响
所有生物保存都需要将样本的温度从常温（通常为 37 °C）降低到最终储存温度 1,3。在冷却阶段前，将样本放入含有低温保护剂（DMSO、甘油、乙二醇、糖等）的介质中，并在大约 4 °C 下保持几分钟（<30 分钟），以达到平衡。样本冷却在大约-1 °C/min的受控速率下完成，以实现哺乳动物细胞的最佳保存 4。对于细菌、病毒和分离的亚细胞成分（细胞器、 DNA、 RNA 和蛋白质），在受控速率下冷却不会遇到太大的问题。在受控速率下冷却减少体积偏移，并允许水流从细胞进入细胞外环境 4-7。这会导致细胞脱水和细胞内溶质（盐、离子、低温保护剂等）的冷冻浓缩，并降低胞内冰形成的可能性。
细胞持续脱水，直到温度降低到玻璃转换温度(Tg)以下，即样本转变为玻璃态（纯水的Tg 约为-135 °C） 8。
虽然细胞脱水对于降低胞内冰形成的概率非常有利，但是当样本储存在高于 Tg的温度下时，脱水将在整个储存期间持续进行，造成更大的损伤。随着样本继续脱水，会对细胞膜、细胞器、蛋白质和核酸造成结构性损伤 1。这种损伤可能对样本造成几个方面的危害，包括激活延迟分子修复或降解途径（凋亡、坏死、未折叠蛋白反应(UPR)、DNA 修复等），如果损伤过于严重，则可能会在解冻后立即导致样本损耗9。
冰冻的分子影响
除了冷冻对样本产生的物理影响，在分子层级上也会产生影响，这是由如下几个因素造成的： 1)可用能量和代谢活动的减少； 2)生化途径的解偶联； 3)应激反应途径的激活9,10。在储存过程中，在降低的动能水平下（降低 10 °C 相当于可用热能降低 3 %），温度的降低会导致新陈代谢和生化途径的减慢1。对于哺乳动物细胞，一个衡量新陈代谢总变化量平均值的简单方法是 Q10，温度每下降 10 °C（Q10为 2），新陈代谢（耗氧量）减少大约 50%11,12。
本质上，无论温度如何，低温储存会减慢所有细胞的生化反应，但不会停止，除非温度低于 Tg。由于生物化学过程和途径与温度有关，即使在-20 °C 和-80 °C 下，生物化学反应仍会发生，导致对样本造成持续性损伤，无论是细胞、亚细胞成分、 DNA、RNA、蛋白质、细菌还是病毒。这些反应通常是不受控制和不完整的，会导致有毒中间化合物的形成和积累，例如自由基、厌氧代谢副产物以及由于必要的回收途径或反应所需的温度抑制而无法清除的废物。这些副产物可能会导致直接损伤或解冻后分子应激反应的激活10。使这一等式更加复杂的是，样本所经历的许多应激源在解冻时会引发分子死亡或生化降解级联反应，即使不会立即致死。这些因素包括代谢解偶联、自由基生成、细胞膜结构和流动性的改变、细胞离子平衡失调、细胞内钙库中钙的释放、渗透通量和低温保护剂的暴露。例如，在储存过程中自由基的生成和积累会直接损伤细胞和分离样本中的 DNA、蛋白质和线粒体的完整性 9,13,14。除了物理影响，自由基的积累还会激活 UPR 和凋亡途径，导致样本进一步降解 15。在许多情况下，在生物保存过程中这些亚致死应激源的积累会导致细胞凋亡的激活，随后由于缺乏能量以及在解冻时应激源的不断“积聚”而发展为继发性坏死。这种亚致死损伤的表现在解冻后可能不明显，可能需要几个小时到几天的时间才能检测到 2,3。
样本储存条件的影响如上所述，储存期间的损伤在物理和分子层级上持续发生。在物理上，样本持续经受由冷冻诱发的脱水和溶质浓缩影响，造成持续和加深的损伤。在生物化学上，反应持续进行，尽管速率大幅降低。在 Q10 为 2 的条件下，与 37 °C (100 %)时相比， 4 °C 时耗氧速率估计为 6 %， -20 °C 时为 1.6 %，-40 °C 时为 0.5 %， -70 °C 时为 0.05 %，-80 °C 时为 0.02 %。理论上讲，这一过程将持续到 Tg 达到所有生化反应停止为止。虽然大幅降低，在长期储存期间这种生化活性仍较为显著。例如，从能量和/或耗氧量计算的角度来看，在-80 °C 下储存 40 天相当于在 37 °C 下储存 1 天（在-80 °C 下储存 1 年相当于在 37 °C 下储存约 9 天）。应注意，基于温度的生化活性抑制并不普遍，因为各个途径、过程和反应的反应各不相同 16。因此，虽然受到高度抑制，但生化过程仍在继续，但以一种解偶联和不受控制的方式进行，从而导致样本持续降解。随着储存温度和间隔时间的增加，这些应激事件会在样本中放大。各个途径、过程和反应对长时间储存的具体反应还不清楚，但人们普遍认为，储存温度对在发现明显损伤之前的样本储存时间有着很大的影响 17,18。例如，在哺乳动物细胞中，在给定温度下储存时间的范围为： 4 °C 下储存不到一周； -20 °C 下不到一个月； -70 °C 和-80 °C 下不到 6-12 个月。储存-196 ºC 的液氮中可有效防止所有热驱动的化学反应，只有电离辐射驱动的活动才能在该温度下进行。据估计，可能需要几千年才能注意到对冷藏保存的培养基的可测量影响 19,20。根据报告，细菌、病毒、 DNA、 RNA 和蛋白质样本可在-80 °C 下储存 1-2 年（或更长时间）。必须注意，这些保存时间仅供参考，单个样本的保存时间应通过检查解冻后特定于预期最终用途的适当参数确定。此外，这些储存时间以最终温度下的稳定保存为基础。在任何温度下将任何样本反复冻融都会导致样本加速降解。
总结样本对冷冻过程的持续物理、生化和分子反应对其质量有很大的影响。在细胞、细菌和病毒样本中可以经常观察到产率、生存能力、功能和繁殖能力的降低，而 DNA、 RNA和蛋白质样本在数量、质量和反应性方面的下降是常见的。假设按照既定的方案解冻样本，质量下降是冷冻和储存过程中应激和降解的直接结果。由于样本在储存过程中不断损伤，样本储存的时间越长，储存温度越高，样本降解的程度就越大。如果样本要长时间储存，最好保存在最低可行的温度下。可在液氮中实现最佳储存，即-196 ºC，此时所有生化反应均停止。考虑到在常规冷冻过程中所发生事件的复杂性，必须要了解样本制备、冷却、储存温度、储存时间和加热对样本整体质量的影响。要获得在给定温度下冷冻和储存的好处，需要权衡单个样本的最终储存目标（时间、最终用途、样本复杂度等）。
参考资料
[1] Baust J. G. Concepts in biopreservation. In: Baust J. G., Baust J. M. (eds) Advances in Biopreservation. New York: Taylor & Francis, 2007, p. 1-14.
[2] Baust J. M., Vogel, M. J., Van Buskirk R., Baust J. G. A molecular basis of cryopreservation failure and its modulation toimprove cell survival. Cell Transplant 2001, 10(7): 561-571.
[3] Baust J. M. Molecular mechanisms of cellular demise associated with cryopreservation failure. Cell PreservationTechnology 2002, 1(1): 17-31.
[4] Mazur P. Principles of cryobiology. In: Fuller, B., Lane, N., Benson, E. (eds) Life in the Frozen State. Boca Raton, FL: CRCPress; 2004, p. 3-65.
[5] Mazur P., Farrant J., Leibo S. P., Chu E. H. Survival of hamster tissue culture cells after freezing and thawing. Interactions between protective solutes and cooling and warming rates. Cryobiology 1969, 6(1):1-9.
[6] Mazur P., Leibo S. P., Chu E. H. A two-factor hypothesis of freezing injury. Evidence from Chinese hamster tissue-culture cells. Experimental Cell Research 1972, 71(2):345-355.
[7] Meryman H. T. The exceeding of a minimum tolerable cell volume in hypertonic suspension as a cause of freezing injury.In: Wolstenholme G. E. W., O’Connor M. (eds) The Frozen Cell. London: Ciba Foundation Symposium Churchill; 1970, p.51-64.
[8] Miller A. A. Glass-transition temperature of water. Science 1969, 163(3873): 1325-1326.
[9] Baust J. M., Corwin W., Van Buskirk R. G., Baust J. G. Biobanking: The future of cell preservation strategies. Biobanking in the 21st century; Ed: Dr. Karimi-Busheri. Springer Pub. In Press. Oct 2015.
[10] Baust J. M. Properties of cells and tissues influencing preservation outcome: molecular basis of preservation-induced cell death. In: Baust J. G., Baust J. M. (eds) Advances in Biopreservation. New York: Taylor & Francis; 2007, p. 63-87.
[11] Fuhram G. J., Fuhram F.A. Oxygen consumption of animals and tissues as a function of temperature. Journal of General Physiology 1959, 42:215.
[12] Raison J. K. The influence of temperature-induced phase changes on the kinetics of respiratory and other membraneassociated enzyme systems. Bioenergetics 1973, 4:285-309.
[13] O’Flaherty C., Beconi M. Beorlegui N. Effect of natural antioxidants, superoxide dismutase and hydrogen peroxide on capacitation of frozen-thawed bull spermatozoa. Andrologia 1997, 29(5):269-275.
[14] Fujita R., Hui T., Chelly M., Demetriou A. A. The effect of antioxidants and a caspase inhibitor on cryopreserved rathepatocytes. Cell Transplant 2005, 14(6):391-396.
[15] Corwin W. L., Baust J. M., Baust J. G., Van Buskirk R. G. The unfolded protein response in human corneal endothelial cells following hypothermic storage: Implications of a novel stress pathway. Cryobiology 2011, 63(1): 46-55.
[16] Southard J. H., van der Laan N. C., Lutz M., Pavlock G. S., Belzer J. P., Belzer F. O. Comparison of the effect of temperature on kidney cortex mitochondria from rabbit, dog, pig and human: Arrhenius plots of ADP-stimulated respiration. Cryobiology 1983, 20:395-400.
[17] Hubel A. Parameters of cell freezing: Implications for the cryopreservation of stem cells. Transfusion Medicine Reviews 1997, 11(3):224-233.
[18] Hubel A., Spindler R., Skubitz A. P. Storage of human biospecimens: Selection of the optimal storage temperature. Biopreservation and Biobanking 2014, 12(3):165-175.
[19] Aswood-Smith, M. J. Low temperature preservation of cells, tissues and organs. In: Aswood-Smith, M. J., Farrant, J. (eds) Low Temperature Preservation in Medicine and Biology. Kent, UK: Pitman Medical Limited; 1980, p. 19-44.
[20] Mazur, P. Freezing of living cells: Mechanisms and implications. American Journal of Physiology 1984, 247(3):125-142.
[2] Baust J. M., Vogel, M. J., Van Buskirk R., Baust J. G. A molecular basis of cryopreservation failure and its modulation toimprove cell survival. Cell Transplant 2001, 10(7): 561-571.
[3] Baust J. M. Molecular mechanisms of cellular demise associated with cryopreservation failure. Cell PreservationTechnology 2002, 1(1): 17-31.
[4] Mazur P. Principles of cryobiology. In: Fuller, B., Lane, N., Benson, E. (eds) Life in the Frozen State. Boca Raton, FL: CRCPress; 2004, p. 3-65.
[5] Mazur P., Farrant J., Leibo S. P., Chu E. H. Survival of hamster tissue culture cells after freezing and thawing. Interactions between protective solutes and cooling and warming rates. Cryobiology 1969, 6(1):1-9.
[6] Mazur P., Leibo S. P., Chu E. H. A two-factor hypothesis of freezing injury. Evidence from Chinese hamster tissue-culture cells. Experimental Cell Research 1972, 71(2):345-355.
[7] Meryman H. T. The exceeding of a minimum tolerable cell volume in hypertonic suspension as a cause of freezing injury.In: Wolstenholme G. E. W., O’Connor M. (eds) The Frozen Cell. London: Ciba Foundation Symposium Churchill; 1970, p.51-64.
[8] Miller A. A. Glass-transition temperature of water. Science 1969, 163(3873): 1325-1326.
[9] Baust J. M., Corwin W., Van Buskirk R. G., Baust J. G. Biobanking: The future of cell preservation strategies. Biobanking in the 21st century; Ed: Dr. Karimi-Busheri. Springer Pub. In Press. Oct 2015.
[10] Baust J. M. Properties of cells and tissues influencing preservation outcome: molecular basis of preservation-induced cell death. In: Baust J. G., Baust J. M. (eds) Advances in Biopreservation. New York: Taylor & Francis; 2007, p. 63-87.
[11] Fuhram G. J., Fuhram F.A. Oxygen consumption of animals and tissues as a function of temperature. Journal of General Physiology 1959, 42:215.
[12] Raison J. K. The influence of temperature-induced phase changes on the kinetics of respiratory and other membraneassociated enzyme systems. Bioenergetics 1973, 4:285-309.
[13] O’Flaherty C., Beconi M. Beorlegui N. Effect of natural antioxidants, superoxide dismutase and hydrogen peroxide on capacitation of frozen-thawed bull spermatozoa. Andrologia 1997, 29(5):269-275.
[14] Fujita R., Hui T., Chelly M., Demetriou A. A. The effect of antioxidants and a caspase inhibitor on cryopreserved rathepatocytes. Cell Transplant 2005, 14(6):391-396.
[15] Corwin W. L., Baust J. M., Baust J. G., Van Buskirk R. G. The unfolded protein response in human corneal endothelial cells following hypothermic storage: Implications of a novel stress pathway. Cryobiology 2011, 63(1): 46-55.
[16] Southard J. H., van der Laan N. C., Lutz M., Pavlock G. S., Belzer J. P., Belzer F. O. Comparison of the effect of temperature on kidney cortex mitochondria from rabbit, dog, pig and human: Arrhenius plots of ADP-stimulated respiration. Cryobiology 1983, 20:395-400.
[17] Hubel A. Parameters of cell freezing: Implications for the cryopreservation of stem cells. Transfusion Medicine Reviews 1997, 11(3):224-233.
[18] Hubel A., Spindler R., Skubitz A. P. Storage of human biospecimens: Selection of the optimal storage temperature. Biopreservation and Biobanking 2014, 12(3):165-175.
[19] Aswood-Smith, M. J. Low temperature preservation of cells, tissues and organs. In: Aswood-Smith, M. J., Farrant, J. (eds) Low Temperature Preservation in Medicine and Biology. Kent, UK: Pitman Medical Limited; 1980, p. 19-44.
[20] Mazur, P. Freezing of living cells: Mechanisms and implications. American Journal of Physiology 1984, 247(3):125-142.
