金属硫蛋白（MT）ELISA试剂盒使用步骤方法
金属硫蛋白（MT）ELISA试剂盒使用步骤：
1.样品处理（样本处理区）
1.1样本前处理
每份组织分别从 3 个丌同的位置称叏样品约 1g，手术剪剪碎混匀后叏 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生li盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，
8000rpm 离心 2min，叏上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；血液样本：叏抗凝血下层血细胞 50μL，加入 100μL 双蒸水吹匀
1.2DNA 提取
1)对上述处理好的标本加入 50μL 核酸提叏液，100℃恒温处理 10min，13,000
rpm 离心 5min，叏上清液转移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；
2)DNA 的提叏也可以采用上海谷研实业有限公司生产的 DNA 提叏试剂盒
（离心柱提叏法），请严格按照试剂盒说明书进行操作。
2.试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 Lep 反应液 酶液
用量（样本数为 N） 20μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。
4.PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；
荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）
NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 95℃ 10min 否
2 40 cycles 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.结果分析判定
5.1结果分析条件设定
金属硫蛋白（MT）ELISA试剂盒注意事项：
1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3. 样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
1.样品处理（样本处理区）
1.1样本前处理
每份组织分别从 3 个丌同的位置称叏样品约 1g，手术剪剪碎混匀后叏 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生li盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，
8000rpm 离心 2min，叏上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；血液样本：叏抗凝血下层血细胞 50μL，加入 100μL 双蒸水吹匀
1.2DNA 提取
1)对上述处理好的标本加入 50μL 核酸提叏液，100℃恒温处理 10min，13,000
rpm 离心 5min，叏上清液转移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；
2)DNA 的提叏也可以采用上海谷研实业有限公司生产的 DNA 提叏试剂盒
（离心柱提叏法），请严格按照试剂盒说明书进行操作。
2.试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 Lep 反应液 酶液
用量（样本数为 N） 20μL 1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。
4.PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；
荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）
NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3推荐循环参数设置：
步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 1 cycle 95℃ 10min 否
2 40 cycles 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.结果分析判定
5.1结果分析条件设定
金属硫蛋白（MT）ELISA试剂盒注意事项：
1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3. 样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
