哺乳动物原代细胞培养的β-半乳糖苷酶（荧光测定）

β半乳糖苷酶：β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。

最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。

以邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红—β—D—半乳吡喃糖苷(CPRG)是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和荧光素二半乳糖苷(FDG)为底物则可用荧光法检测其活性。

此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学(FACS)分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。

试剂和器材： 
1. 反应缓冲液：100mmol/L醋酸钠，100mmol/L KCl、2%（体积分数）Triton X-100、5mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），pH4.3；
2. 底物：1.7mmol/L4-甲基-伞形酮-β-D-半乳糖苷（4-MUG）或邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)，溶于反应缓冲液中；
3. 微量离心机；
4. 荧光计：透射光波长355nm，激发光波长460nm，比色皿可容纳200μl样品；
5. 流式细胞学(FACS)分析
6. 37℃水浴锅；

实验方法：
哺乳动物原代细胞培养。
原代细胞收集后。
1. 用两倍体积的缓冲液进行稀释，然后于0—4℃下在微量离心机中离心10min以获得具有梯度的沉淀物；
2. 在0.25ml的反应缓冲液中重悬沉淀；
3. 与等体积的底物进行混匀，37℃孵育1h。使用0.25ml的反应缓冲液代替底物来作为样品空白；
4. 再配有一份底物空白；
5. 1h后测定荧光；
6. 流式细胞学(FACS)分析