用差速离心法从大鼠肝脏中分离原代细胞重线粒体组分

                          用差速离心法从大鼠肝脏中分离原代细胞重线粒体组分

试剂和器材
1. 甘露醇缓冲液：0.2mol/L甘露醇、50mmol/L蔗糖溶液、10mmol/L KCl、1mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4；
2. 玻璃棒；
3. Dounce匀浆器（20—30ml宽松配制，Wheaton B型）；
4. 高转矩桥式电动机（半导体开关控制）；
5. 高速离心机，配有可容纳40—50ml离心管的固定角转子低速冷冻离心机；
6. Potter-Elvehjem匀浆器，20—40ml间隙为0.07mm；
7. 注射器（内径约0.8mm），带金属套管针；

实验方法：
   所给体积适用于约10g的肝脏。第6步以后所有操作须在0—4℃下进行。
1. 对一雄性大鼠过夜禁食，使其糖原耗尽；
2. 颈椎脱臼法处死大鼠，迅速切除肝脏并称重；
3. 将肝脏转移到置于冰上的烧杯中，用剪刀小心地剪碎（肝脏碎片的大小不得超过3mm3），然后用甘露醇缓冲液混悬（每克肝脏使用约4ml缓冲液）；
4. 将一半的液体和组织碎片倒入Potter-Elvehjem匀浆器，用研杵上下研磨5—6次（旋转速度约为700r/min），另一半的样品也重复该操作；
5. 将匀浆液平分到2个离心管中，并于1000g离心10min；
6. 倾倒上清后，放置在冰上。取30ml缓冲液重悬沉淀，用Potter-Elvehjem匀浆器的研杵研磨2—3次进行匀浆，并重复步骤5操作；
7. 倾倒后合并上清，再于1000g离心10min；
8. 用连在20ml注射器的金属套管针去除上清；
9. 4000g离心上清15min；
10. 用金属套管针和注射器去除4000g离心所得上清。为尽可能除去上清，针头尽量靠近凹液面；
11. 同样将致密的棕色沉淀上堆积的疏松粉红色物质小心地吸出，用纸片擦拭管内壁以去除附着液体；
12. 每管加入10ml缓冲液，用玻璃棒搅拌自然状态下重悬沉淀；
13. 在Dounce匀浆器中用研杵轻轻地研磨3次以完成重悬；
14. 用缓冲液补偿到原体积，再倾倒至新管中；
15. 重复步骤9—14 3次；
16. 最后，将纯化了的重线粒体重悬于合适的介质中（与后序分析相一致）；