原代细胞核膜的分离

试剂和器材： 
1. DNA酶Ⅰ；
2. KCl（1mol/L溶于20mmol/L Tris-HCl，pH7.4）；
3. MgCl2（1mol/L储存液）；
4. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（无水乙醇配制的1mol/L储存液）；
5. 纯化的细胞核；
6. 缓冲液：2mmol/L Tris-HCl，pH7.4；
7. 膜悬浮缓冲液（ESB）：0.25mol/L蔗糖、2mmol/L Tris-HCl，pH7.4；
8. 梯度溶液：1.0mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、2.0mol/L的蔗糖溶于2mmol/L Tris-HCl，pH7.4；
9. 除了MgCl2外的所有溶液须含0.1mmol/L苯甲基磺酰氟；
10. Abbé折光计；
11. 高速离心机，配有固定角转子和离心管；
12. 超速离心机，配有固定角和吊桶式转子、离心管；
13. 相差显微镜；
14. 紫外分光光度计（配石英比色皿）；

实验方法：
   除特殊注明外，所有操作均在0—4℃下进行。
1. 将纯化的原代细胞细胞核浸于缓冲液中孵育10min使之膨大去凝缩。之后约10000g离心10min，用缓冲液重悬沉淀，并重复这一步骤2次；
2. 用含DNA酶Ⅰ（0.01g/L）的缓冲液重悬凝胶样溶胀的细胞核沉淀。充分混匀并室温孵育30min，孵育的中途将上清调节至含约0.1mmol/L MgCl^₂。随着DNA被切割裂解，染色质很快失去了凝胶状特性。可通过相差显微镜检测核膜“影子”的产生；
3. 采用固定角转子或吊桶式转子，约60000g离心30min；
4. 用缓冲液重悬核膜粗产物，并再次离心。重复这一步直至DNA释放为止（即监测上清在280nm下的吸光度，直至达到一很低平台）；
5. 选择性地用KCl溶液洗涤获得地核膜，以加速离子结合蛋白，尤其是组蛋白的去除。然后约60000g离心30min；
6. 将核膜用核膜悬浮缓冲液重悬，覆盖配制的4个梯度溶液，置于吊桶式离心机中离心若干小时或过夜，以收集核膜等密度层；
7. 纯化的核膜应该主要聚集在1.5mol/L与1.8mol/L两蔗糖层的界面，用巴斯德吸管小心地从梯度液中移出核膜层；
8. 通过相差显微镜，或者通过琼脂糖包埋进行负染和/或薄片电镜，检查核膜的完整性；
9. 对纯化标本进行必须的生化分析，如SDS-PAGE或是酶学实验；内源性过氧化物酶是大鼠肝脏核膜的一个合适的标志，同时也存在Mg-ATP酶以及很多内质网酶；