FITC标记抗体-Marsshall氏法

 

材料：

抗体球蛋白溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25—50ml）、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻璃棒、棉线及烧杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等；

 

方法与步骤：

1.       抗体的准备。量取适量已知浓度的球蛋白溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最终球蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌速度适当，即以不起泡沫为宜搅拌5—10min；

2.       荧光素的准备。根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素的比例，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末；

3.       结合（或称标记）。将称取的荧光色素缓慢加入到球蛋白溶液中，并不停地搅拌，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻璃棒上，在大约5—10min内加完。然后继续搅拌12—18h。因荧光素与球蛋白结合期间要求必须保持蛋白溶液于4℃左右，所以需要即使地添冰或去水。亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中；

4.       透析。荧光素与球蛋白结合完毕后，将球蛋白的溶液以2500r/min离心20min，除去其中少量的沉淀物后，装入透析袋中再置于烧杯中，在0—4℃下用pH8.0的缓冲盐溶液透析过夜；

5.       过柱。取透析过夜的标记物，过葡萄糖凝胶G-25或G-50柱，分离出游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定；