快速体积超分辨光片成像解析CD20与治疗抗体分子互作

关键词：CD20；DNA-PAINT；晶格光片显微镜

CD20 是 B 细胞表面广泛表达的膜受体，也是多种治疗性单克隆抗体的核心作用靶点，但其与抗体结合后的纳米级膜组织重排机制，以及后续免疫激活的分子细节始终缺乏清晰的全细胞成像证据。本研究开发了基于双染料自淬灭探针的快速 DNA-PAINT 成像技术，并将其与晶格光片显微镜结合，实现了全细胞水平的三维超分辨成像，系统解析了内源性 CD20 与三类临床常用治疗抗体的分子互作模式，修正了现有治疗性抗体的分类体系，为免疫治疗药物的理性设计提供了直接的分子成像依据。

该研究由 Arindam Ghosh、Mara Meub、Dominic A. Helmerich、Julia Weingart、Patrick Eiring、Thomas Nerreter、K. Martin Kortüm、Sören Doose、Markus Sauer 共同完成，Arindam Ghosh 与 Markus Sauer 为通讯作者，论文题为 Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy，发表在 Science。

重要发现

01

双染料成像探针的开发与二维成像性能验证

传统DNA-PAINT 技术依赖单荧光标记的成像链与靶标对接链的瞬时结合实现超分辨成像，但游离成像链产生的强背景信号限制了探针使用浓度，导致成像时间极长，难以应用于三维大体积样本。研究团队设计了末端标记两个相同荧光染料的成像链探针，游离状态下两个染料会形成非荧光的 H 型二聚体发生自淬灭，仅在与对接链结合后才恢复荧光信号，该技术被命名为双染料成像 DNA-PAINT，即 TDI-DNA-PAINT。

研究团队筛选了多种有机染料，确认两款染料具备优异的自淬灭与荧光恢复性能。光谱表征显示，双标记探针在结合对接链后荧光强度可提升8.7 倍；荧光相关光谱实验证实，约 50% 的游离探针会形成寿命长于 1 毫秒的非荧光二聚体，结合短寿命二聚与碰撞淬灭效应，有效降低了游离探针的背景干扰。在相同成像条件下，双染料探针可使用 50 倍于传统探针的工作浓度，5 分钟内采集到的定位事件数量相当于传统探针 60 分钟的成像结果，有效成像速度提升约 13 至 14.5 倍。同时双染料探针的定位精度更优，二维成像下横向定位精度可达 4.1 至 4.5 纳米，优于传统探针的 5.3 纳米，且未改变探针与对接链的结合时长，可兼容现有 DNA-PAINT 的成像序列体系。基于两款不同光谱的自淬灭染料，研究还实现了双色 TDI-DNA-PAINT 成像，可同时解析两种细胞内靶标的纳米分布。

02

三维全细胞超分辨成像体系的构建

为实现全细胞的三维超分辨成像，研究团队将TDI-DNA-PAINT 与晶格光片显微镜结合，利用非球面镜片引入像散实现三维定位，搭建了 LLS-TDI-DNA-PAINT 成像体系。晶格光片显微镜本身具备快速体积成像、光毒性低的优势，但受衍射极限限制分辨率不足；传统 PAINT 技术虽分辨率高，但成像速度慢，完成全细胞三维成像需数天时间，二者结合后可兼顾成像速度与分辨率。

实验采用厚度为1.8 微米的光片对样本进行逐层扫描，步长为 500 纳米，每个成像面采集 2500 帧图像。在 2.5 纳摩尔的探针浓度下，4 小时内即可完成尺寸约 87 微米 ×72 微米 ×8.8 微米的全细胞体积成像，采集到超过两千万个分子定位事件；若使用传统 DNA-PAINT 探针，同等体积成像需约 20 小时。成像性能表征显示，该体系的横向定位精度可达 14 至 24 纳米，轴向定位精度可达 53 至 59 纳米，可清晰分辨细胞内远离盖玻片区域的微管纤维结构，仅在细胞中心区域因标记密度较高出现定位精度的小幅下降。该体系首次实现了数小时内完成全细胞体积的分子级分辨率三维成像，解决了传统超分辨技术大体积成像耗时过长的痛点。

03

CD20 与治疗性抗体的膜分布互作解析

利用搭建的三维成像体系，研究团队对Raji B 细胞上内源性 CD20 与利妥昔单抗、奥法妥木单抗、奥妥珠单抗三类治疗抗体的结合模式进行了解析，同时纳入了结合亲和力更低的对照抗体 2H7。现有理论将抗 CD20 抗体分为 I 型与 II 型，认为 I 型抗体可交联 CD20 并激活补体依赖细胞毒性，II 型抗体不具备交联能力，主要介导抗体依赖细胞毒性。

二维成像实验最初观察到基底膜上的丝状CD20 - 抗体复合物结构，经三维全细胞成像验证后确认，该结构并非平面上的抗体交联聚合，而是 B 细胞微绒毛被挤压在盖玻片与细胞膜之间形成的表面伪影。三维成像结果显示，CD20 在 B 细胞表面的微绒毛结构上高丰度表达，抗体结合后会通过交联作用稳定微绒毛结构，使 CD20 - 抗体复合物在微绒毛上富集。三类临床抗体均能不同程度地交联 CD20 并诱导微绒毛富集，其中利妥昔单抗的交联与富集效应最强，奥法妥木单抗次之，奥妥珠单抗在 5 微克每毫升浓度下效应较弱，但升高浓度后交联效应同样显著。这一结果直接证明 II 型抗体同样具备 CD20 交联能力，推翻了现有抗体分类的核心依据。定量统计显示，室温下利妥昔单抗处理组的细胞膜顶端定位密度最高，冰上处理会降低所有抗体的交联与富集程度，证实该过程具有温度依赖性。

04

活细胞动态成像与B 细胞极化效应

为捕捉抗体结合后的细胞动态过程，研究团队利用双色晶格光片显微镜对活B 细胞进行了四维实时成像，同时标记细胞骨架肌动蛋白与 CD20 抗体，追踪 30 分钟内的细胞形态与分子分布变化。

实验结果显示，利妥昔单抗处理后，B 细胞会快速发生极化，CD20 - 抗体复合物逐渐向细胞一侧聚集，同时肌动蛋白重排驱动微绒毛伸长并稳定，在细胞极化侧形成密集的突起结构。微绒毛的长度与抗体浓度正相关，5 微克每毫升利妥昔单抗处理下，微绒毛最大长度可达 7.3 微米。对照抗体 2H7 的极化与微绒毛稳定效应更弱，即使浓度提升至 20 微克每毫升，效果仍不及低浓度利妥昔单抗。奥法妥木单抗在 5 微克每毫升下仅诱导微弱的微绒毛富集，浓度提升至 10 微克每毫升后可引发明显的细胞极化与长微绒毛结构。奥妥珠单抗在 5 至 10 微克每毫升下无显著极化效应，浓度升至 20 微克每毫升时可诱导长微绒毛，但仅少数细胞出现极化迹象。进一步的共标记实验证实，CD45 分子会被排除在微绒毛尖端之外，说明微绒毛区域存在明确的膜蛋白分选机制。

创新与亮点

本研究突破了两项核心成像技术瓶颈：一是解决了传统DNA-PAINT 技术背景高、探针浓度受限、成像速度慢的固有缺陷，通过双染料自淬灭探针设计，将二维成像速度提升十余倍，同时实现了更高的定位精度；二是首次将快速 DNA-PAINT 技术与晶格光片显微镜高效结合，实现了数小时内完成全细胞三维超分辨成像，兼顾了大体积、高速度与分子级分辨率。

该技术在生物医疗领域具备明确应用价值：在免疫治疗研究中，它可在天然内源性表达水平下解析膜蛋白靶点与抗体药物的纳米级互作，直接验证药物作用的分子机制，修正了抗CD20 抗体的分类认知，为抗体工程改造、药效优化提供了可视化研究工具。该技术体系可拓展至其他膜蛋白靶点与药物分子的互作研究，为肿瘤免疫、自身免疫病的药物研发提供支撑。

总结与展望

本研究开发的TDI-DNA-PAINT 技术有效突破了超分辨成像的速度瓶颈，结合晶格光片显微镜实现了全细胞水平的快速三维纳米成像，系统揭示了 CD20 与治疗性抗体的分子作用机制，更新了治疗性抗体的分类体系，为免疫治疗药物研发提供了全新的成像研究手段。未来可通过筛选更高效的自淬灭染料进一步提升成像性能，拓展多色、多靶点成像能力，推动该技术在更多生物医学研究场景中的应用。

论文信息

声明：本文仅用作学术目的。 

Arindam Ghosh et al. ,Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy.Science387,eadq4510(2025).

DOI:10.1126/science.adq4510