从头合成与补救合成途径解析HAT筛选为何能筛出杂交瘤细胞
HAT 筛选原理｜杂交瘤细胞为什么能在 HAT 培养基中活下来
摘要：HAT 筛选利用嘌呤与嘧啶的补救合成途径，把杂交瘤细胞从骨髓瘤细胞和未融合脾细胞中区分出来。本文讲清其中的酶学逻辑。
关键词：HAT 筛选、HAT 培养基、杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞、单克隆抗体、杂交瘤细胞培养
HAT 培养基含次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T）。三个字母对应两套 DNA 合成途径，理解这两套途径的分工，就能理解筛选为什么成立。
正常细胞有两条路：从头合成，以及利用现成碱基的补救合成。从头合成以氨基酸为原料，经一系列酶促反应生成嘌呤与嘧啶，其中二氢叶酸还原酶是关键酶之一；补救途径则直接把培养液中现成的次黄嘌呤与胸腺嘧啶接上去，需要 HGPRT 与胸腺嘧啶激酶。两条路平时并行运转，缺一条还能靠另一条维持。
氨基蝶呤抑制二氢叶酸还原酶，从头合成被切断，细胞只能依赖补救途径。此时谁有 HGPRT、谁能利用外源碱基，就成了生死线。HAT 中的次黄嘌呤与胸腺嘧啶正是为补救途径提供的底物，它们不是营养补充，而是给有酶的一方留出的通路。理解了这一点，也就明白为什么缺料与足料对筛选结果的影响并不相同。
骨髓瘤细胞（NS-1、SP2/0）是 HGPRT 缺陷株，补救途径不通，在 HAT 中死亡。未融合的脾细胞虽有 HGPRT，但在体外不能长期增殖，逐渐消失。杂交瘤细胞从脾细胞继承了 HGPRT，从骨髓瘤细胞继承了无限增殖能力，成为能存活并扩增的那一类细胞。
摘要：HAT 筛选利用嘌呤与嘧啶的补救合成途径，把杂交瘤细胞从骨髓瘤细胞和未融合脾细胞中区分出来。本文讲清其中的酶学逻辑。
关键词：HAT 筛选、HAT 培养基、杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞、单克隆抗体、杂交瘤细胞培养
HAT 培养基含次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T）。三个字母对应两套 DNA 合成途径，理解这两套途径的分工，就能理解筛选为什么成立。
正常细胞有两条路：从头合成，以及利用现成碱基的补救合成。从头合成以氨基酸为原料，经一系列酶促反应生成嘌呤与嘧啶，其中二氢叶酸还原酶是关键酶之一；补救途径则直接把培养液中现成的次黄嘌呤与胸腺嘧啶接上去，需要 HGPRT 与胸腺嘧啶激酶。两条路平时并行运转，缺一条还能靠另一条维持。
氨基蝶呤抑制二氢叶酸还原酶，从头合成被切断，细胞只能依赖补救途径。此时谁有 HGPRT、谁能利用外源碱基，就成了生死线。HAT 中的次黄嘌呤与胸腺嘧啶正是为补救途径提供的底物，它们不是营养补充，而是给有酶的一方留出的通路。理解了这一点，也就明白为什么缺料与足料对筛选结果的影响并不相同。
骨髓瘤细胞（NS-1、SP2/0）是 HGPRT 缺陷株，补救途径不通，在 HAT 中死亡。未融合的脾细胞虽有 HGPRT，但在体外不能长期增殖，逐渐消失。杂交瘤细胞从脾细胞继承了 HGPRT，从骨髓瘤细胞继承了无限增殖能力，成为能存活并扩增的那一类细胞。
图1：HAT 筛选的原理：从头合成途径与补救合成途径
这套设计有一个常被忽略的前提：筛选是负向的。它不挑出能分泌目标抗体的细胞，只淘汰掉不能活的细胞。因此 HAT 筛选之后，孔里能长的克隆仍然混杂，还需要一轮基于抗体特异性的检测。把 HAT 当成阳性筛选，是初学者常见的误读。
还要区分 HAT 与 HT。HT 只含次黄嘌呤与胸腺嘧啶，不含氨基蝶呤，用于筛选后的恢复培养——此时细胞不必继续承受氨基蝶呤的压力，但仍需要补救途径的底物。若把 HT 当作 HAT 使用，等于没有做筛选，未融合的骨髓瘤细胞会在压力解除后重新长起来。
筛选周期取决于细胞状态。一般在 HAT 中维持两周左右，期间可视情况半量换液；待孔内出现可见集落、且未融合细胞基本消失后再转出。转出过早，残留的缺陷株会混进来；转出过晚，细胞长期处在代谢压力下，状态会变差，扩增阶段需要更长时间恢复。
配制与保存上还有两点。氨基蝶呤对光敏感，含 HAT 的培养基应避光保存，配制后不宜久置；HAT 各组分的浓度是按补救途径的需求设定的，自行加量不会提高筛选效果，反而可能掩盖部分缺陷株的表现。
值得一提的是，氨基蝶呤的抑制作用是可逆的。撤去后从头合成通路会逐步恢复，这也是筛选结束后转回常规培养基可行的原因。但恢复需要时间，转出后短期内细胞仍偏脆弱，扩增阶段不宜立即提高传代比例。
上海曼博生物可提供 Hybriboost 促杂交瘤细胞生长剂及 HAT 筛选阶段的技术支持。该产品仅面向科研用途，不得用于人体临床诊断或治疗。
