邻近诱导RIPTAC三元复合物协同效应测定方法

在RIPTAC研发中，三元复合物协同效应的测定是关键环节；上海玮驰可提供瑞孚迪(Revvity)三元复合物检测试剂，支持自由搭配TP与EP。以下技术内容供参考。

*内容来源：新药趋势

在化学诱导接近（CIP / PROTAC / Molecular Glue）研究中，协同效应（cooperativity, α）用来量化三元复合物（Protein A–Compound–Protein B）形成的稳定性是否高于各自二元复合物之和，是评价分子胶或PROTAC质量优劣的核心参数之一。协同效应（Cooperativity, α）是双功能分子（PROTAC/KAT-TCIP/ 分子胶）介导三元复合物形成的核心量化指标，定义为二元结合解离常数与三元结合解离常数的比值：

定义通式：

或者

α > 1 ⇒ 正协同（三元复合物更稳定）；

α ≈ 1 ⇒ 无协同；

α < 1 ⇒ 负协同。

七大常用方法对比表：

方法	标记	溶液相	样品量	直接出 α	核心优势	主要局限
TR-FRET	需	✅	极少	✅	经典、灵敏、可发文章	需荧光标记
MST	可选	✅	极少	✅	样品省、适合分子胶	缓冲敏感、需标记
ITC	❌	✅	中	✅	热力学金标准	用量大、Kd范围限制
SPR	❌	❌(表面)	少	✅	动力学+亲和	固定化偏差
BLI	❌	❌(表面)	少	✅	快速、较简易	固定化、分辨率略低
FIDA	配体标记	✅	极少	✅	一次分二元/三元	仪器少、配体需标
FP	需	✅	少	✅	简单、初筛	只适合合适 FP 配体
FEP/MD	❌	—	—	✅(预测)	机制解析/设计	靠结构、近似误差

一、TR-FRET（Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer，时间分辨荧光共振能量转移）
1. 基本原理

•利用 铽（Tb³⁺）或 Eu³⁺ 供体（长荧光寿命，~ms）与 荧光受体（如 Alexa Fluor 647、FITC） 之间的非辐射能量转移•只在 供体–受体距离 1–10 nm 内发生 ⇒ 指示三元复合物形成•时间分辨读取可消除背景短寿命荧光（血清、缓冲液等）

2. 实验过程（三元协同测定标准做法，如 Nix et al., 2025）

1.固定其中一个蛋白（如 His-p300BD）并通过 Tb-标记抗-His 抗体标记（供体）2.加入荧光标记配体或第二蛋白（受体）3.二元结合实验：滴定配体 → 得到 Kd(binary)4.三元结合实验：预先加入过量 Protein B（BCL6BTB），再同样滴定配体 → 得到 Kd(ternary, apparent)5.拟合曲线，计算：

3. 特点

•✅ 溶液相，接近生理条件

•✅ 样品消耗极低（μL 级）

•✅ 可多次滴定、重复性好

•✅ 可直接算出 α

•❌ 需要荧光标记（蛋白或配体），可能引入位阻

•❌ 需避免荧光淬灭 / 自缔合干扰

4. 最适合场景

•PROTAC / 分子胶三元协同效应的核心生化验证与正式发文•中等通量 SAR 研究

二、MST（Microscale Thermophoresis，微量热泳动）
1. 基本原理

•温度梯度下，分子因大小、电荷、水化层不同发生 热泳迁移•配体结合蛋白（或三元复合物形成）会改变迁移率（Thermophoretic Mobility）•荧光标记任一组分（通常配体或 Protein A），也可用非标记红外-MST（较少见）

2. 实验过程（分子胶常用）

1.荧光标记配体（或 POI/E3 蛋白）2.固定浓度荧光分子，系列稀释另一组分（蛋白 A / 蛋白 B / 配体）3.二元结合：配体 + Protein A → Kd(binary)4.三元结合：预先加饱和 Protein B，再滴定配体 → Kd(ternary, apparent)5.比值 → α

3. 特点

•✅ 样品量极少（≤ 5 µL/孔）

•✅ 溶液相，无需固定化

•✅ 对分子量无严格要求，适合弱结合

•✅ 可直接得 α（需正确设置三元对照）

•❌ 荧光标记可能影响结合

•❌ 对缓冲组成敏感（盐、去ergent、DMSO 需严格控制）

•❌ 拟合受毛细管效应影响，重复性与 ITC 比略逊

4. 最适合场景

•分子胶（Molecular Glue）三元协同的首选用生化验证方法之一•样品稀缺、需快速判断正负协同趋势

三、ITC（Isothermal Titration Calorimetry，等温滴定量热法）

1. 基本原理

•直接测量结合过程中释放/吸收的热量 ⇒ 得到：•Kd（亲和）•ΔH（焓变）•ΔS（熵变）•n（化学计量比）•三元协同通过 Gibbs 自由能叠加计算：

1.测定 Protein A + Ligand（Kd₁, ΔG₁）2.测定 Protein B + Ligand（Kd₂, ΔG₂）3.三元：预混 Ligand + Protein B，滴定 Protein A（或反向）4.从 ΔG_ternary 与 ΔG₁+ΔG₂ 差值 → ΔΔG_coop → α

•✅ 无需任何标记（Label-free）

•✅ 直接获得热力学参数（焓/熵驱动信息）

•✅ 可直接算出 α（最严谨）

•❌ 样品用量较大（µM 级，数百 µL）

•❌ Kd 需在 ~0.1–10 µM 范围最佳；太强/太弱均难拟合

•❌ 低通量

•三元协同效应测定的热力学金标准•机制深入解析（焓驱动 vs 熵驱动协同）、正式发表论文主图

•金膜表面固定 Protein A•配体流经 → 形成二元捕获•再流 Protein B → 若形成三元复合物，响应值（RU）升高、解离变慢•实时监测结合/解离 → kon / koff / KD

1.固定 Protein A（如 VHL / BCL6）2.低浓度配体流过 → 捕获（二元表面）3.系列浓度 Protein B 流过 → 饱和结合 → Kd(ternary, apparent)4.对比单独 Protein B–Ligand Kd(binary) → α = Kd(binary)/Kd(ternary)5.亦可通过 解离速率延长（koff↓） 定性/半定量协同强度

•✅ 实时动力学信息（kon / koff）•✅ Label-free•✅ 可直接得 Kd → α•❌ 需蛋白固定化（可能破坏活性/引入取向偏好）•❌ 表面效应（mass transport、rebinding）•❌ 对弱三元复合物灵敏度有限

•需要 动力学参数（ residency time ） 的研究•PROTAC 停留时间与协同稳定性关联分析

•类似 SPR 但基于 光干涉波长变化•生物传感器尖端的分子结合引起干涉图谱位移 ⇒ 实时结合曲线

•传感器 tip 偶联 Protein A（或抗-Tag 捕获）•浸入股 Ligand → 二元捕获•浸入股 Protein B → 三元形成信号•拟合 Kd(B 在 ligand 存在下) vs 单独 B–Ligand Kd → α

•✅ Label-free•✅ 比 SPR 操作简便、通量稍高•✅ 可直接得 Kd → α•❌ 固定化仍可能引入偏差•❌ 分辨率与灵敏度略低于 SPR（尤其快解离体系）

•快速筛选 PROTAC / Glue 三元形成能力•初筛大量衍生物（配合后期 ITC / TR-FRET 精测）

•共聚焦检测下单分子荧光强度与 扩散时间（τ_D） 成正比•二元 → 三元复合物形成 → 分子量 ↑ → τ_D 延长•通过拟合 扩散时间分布 直接区分 Free-Ligand / Binary / Ternary

1.极低浓度荧光标记配体2.加 Protein A → τ_D 变化（二元）3.再加 Protein B → τ_D 进一步延长（三元）4.软件直接输出各物种占比 ⇒ 拟合 Kd(binary)、Kd(ternary) → α

•✅ Label-free 蛋白（只标配体）•✅ 溶液相，单分子水平•✅ 一次实验可区分游离/二元/三元 ⇒ 直接得 α•❌ 需高质量荧光标记配体•❌ 仪器普及度较低•❌ 对极弱/瞬逝三元体系分辨率有限

•追求 单实验完整解析二元/三元比例，且样品极少•方法学前沿实验室或高端服务平台

七、FEP / MD 计算（Free Energy Perturbation / Molecular Dynamics）
1. 基本原理

•FEP（+ TI / MBAR）：炼金术路径计算结合自由能差•分别计算：•ΔG_bind(A–L)•ΔG_bind(B–L)•ΔG_bind(A–L–B)•协同自由能：常辅以：•MM-GBSA / MM-PBSA 粗估界面贡献•共晶结构 + PISA 分析 Neointerface BSA

1.构建三元/二元复合物结构（X-ray / homology model）2.体系溶剂化、平衡 MD3.FEP  λ-window 采样4.自由能积分 → α 预测

•✅ 不消耗样品、无标记

•✅ 可解释协同来源（残基贡献、熵-焓分解）

•✅ 能预测未合成类似物 α

•❌ 依赖初始结构质量

•❌ 计算量大，误差 ±0.5–1 log 单位常见

•❌ 需专业软件/算力，不能替代实验验证

4. 最适合场景

•早期药物设计阶段筛选 linker / warhead 改造对协同影响•与实验（ITC / TR-FRET）联合解释 Neointerface 成因其他的方法还包括：A:AlphaScreen / Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (ALPHA)•蛋白 A 与蛋白 B 分别偶联给 Donor / Acceptor 微珠•只有形成三元复合物才产生发光信号•滴定 PROTAC 得三元 EC50；对照二元体系得各半复合物响应•协同通过 Hill 斜率变化或 信号饱和浓度偏移定性/半定量评估•常用于高通量筛选，较少直接给出 α，但可配合 Kd 标定B. 凝胶 shift / Native PAGE 迁移率改变•二元（蛋白 + ligand）vs 三元（protein A + ligand + protein B）•出现新条带 → 三元复合物形成•可尝试滴定各组分做 Band Intensity → Fraction Bound → 估算 Kd•局限：低通量、平衡易受电泳条件干扰，多用于概念验证C: 核磁共振（STD-NMR / WaterLOGSY / DOSY）•配体加蛋白 A / B / (A+B)•观察配物 STD 增益或 NOE 差异•若三元态形成，配物同时接触两种蛋白 ⇒ 特征增强信号•可结合滴定做定量 Kd(ternary)•对溶解度要求高，适合机理研究而非常规 SARD: 质谱法（ESI-MS / nanoESI）•气相检测三元非共价复合物 [ProteinA–Ligand–ProteinB]^n+•可滴定获得近似 Kd•特别适合较稳定、紧凑的三元体系（如分子胶）•不能严格模拟溶液热力学，但提供直接物证E:  细胞 NanoBRET 三元招募实验（间接）•融合 NanoLuc 至 Protein A，荧光标签至 Protein B•加 PROTAC → BRET 信号上升 ⇒ 细胞内三元形成•竞争实验（加单价配体）可半定量协同需求•这是 功能相关性证据，不能直接替代生化 α，但常作为体内关联指标（两篇文献均用 NanoBRET 作佐证以上是关于这几种方法的简要介绍，每一种方法都可以找到对应的例子。下面举例重点介绍FRET和ITC方法一般的最严谨实验测定的组合：FP/TR-FRET 初筛 + ITC 精确定 Kd & ΔG，再用NanoBRET进行佐证。第一个例子是《A Bivalent Molecular Glue Linking Lysine Acetyltransferases to Oncogene-induced Cell Death》（Nix et al., bioRxiv 2025）——KAT-TCIP / p300–BCL6 体系

•蛋白：重组 p300 溴结构域（p300BD, 1040–1161 aa）、BCL6 BTB 结构域（BCL6BTB, 5–129 aa）•化合物：KAT-TCIP（TCIP3、MNN-02-155 等双价分子），单价参照 NEG1/NEG2•方法：•Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer（TR-FRET）二元 & 三元结合实验•Isothermal Titration Calorimetry（ITC）测定二元/三元热力学参数

2. TR-FRET 测定与 α 的计算

（文献 Fig. 6E & Supplemental Fig. 10）

•固定 Tb-标记 anti-His 抗体 + 6×His-p300BD•加荧光探针 MNN-06-112（p300 BD 探针）•滴定 MNN-02-155（或 TCIP3 母核）•得到 Kd(binary) = Kd(p300–MNN-02-155)

•预先加入过量 BCL6BTB（≫ Kd，保证饱和占据）•再滴定 MNN-02-155 到 p300BD-Tb 体系•此时测得的位移曲线反映 p300 对配体在 BCL6 存在下的亲和力 = Kd(ternary apparent)

（3）协同系数计算（正文 Materials & Methods / Results）

"Cooperativity (α) is defined as the ratio of binary to ternary complex dissociation constants (Kds). We followed a reported procedure to measure α for p300, defined as the ratio between the Kd for p300-MNN-02-155 binding versus the Kd for p300-[BCL6-MNN-02-155] binding."•实测野生型 p300：α ≈ 6.8（TR-FRET），表明明显正协同•突变体 p300^Q1083A：α ↓；p300^Q1083R（空间冲突）：α ≈ 1（无协同）文中特别指出 TCIP3 与 MNN-02-155 给出相近 α（α = 4.2–6.9），且刚性链接子（降低熵罚）倾向于增强 α。

3. ITC 双向验证（Fig. 6F & Suppl. Fig. 10E/F）
 

分别测定：•p300BD + TCIP3（二元）•BCL6BTB + TCIP3（二元）•p300BD + BCL6BTB + TCIP3（三元，先预孵育其中两个组分）计算双向 α：二者在同一数量级，微小偏差来自拟合方向不同，整体证明分子胶诱导稳定三元协同复合物。（二）《Structure-Based Design of a Macrocyclic PROTAC》(Testa et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2020) —— macroPROTAC-1 / VHL–Brd4^BD2 体系

•蛋白：VCB (VHL-ElonginC-ElonginB)，Brd4^BD2 / Brd2^BD1•化合物：线性 MZ1；大环 macroPROTAC-1（化合物 1）•方法：•Fluorescence Polarization（FP）竞争置换实验 → α•ITC → 二元/三元 Kd、ΔG、α

2. FP 法测定三元协同（Fig. 2A & Table 1 注释）

步骤：1.荧光标记 HIF-1α 肽与 VHL 结合（高 FP）2.加 PROTAC：•单独 → 置换 HIF-1α（反映 VHL 二元亲和力）•预孵 Brd4^BD2 → 左移曲线 ⇒ 三元复合物亲和力提升3.由剂量–响应位移计算 Kd(app)，再算 α报道数值：•MZ1：VHL : MZ1 : Brd4^BD2 → α ≈ 17.6•macroPROTAC-1：VHL : 1 : Brd4^BD2 → α ≈ 20•macroPROTAC-1 对 Brd2^BD1：α ≈ 0.7（负协同 / 无选择性）说明大环锁定构象后，BD2 选择性协同增强，BD1 无协同甚至削弱。

3. ITC 精确 Kd & α 计算（Table 1）

测定：•二元：VCB + macroPROTAC-1（Kd ≈ 47 nM）；Brd4^BD2 + macroPROTAC-1（Kd ≈ 180 nM）•三元：VCB + (macroPROTAC-1 pre-bound Brd4^BD2)用 Gibbs 自由能叠加关系：

协同自由能：Table 1 给出：•VHL : macroPROTAC-1 : Brd4^BD2 ⇒ α ≈ 20•VHL : macroPROTAC-1 : Brd2^BD1 ⇒ α ≈ 0.7与 FP 结果一致。

参考文献：

(1) Nix, M. N.; Gourisankar, S.; Sarott, R. C.; Dwyer, B. G.; Nettles, S. A.; Martinez, M. M.; Abuzaid, H.; Yang, H.; Wang, Y.; Simanauskaite, J. M.; et al. A Bivalent Molecular Glue Linking Lysine Acetyltransferases to Oncogene-Induced Cell Death. bioRxiv 2025, 2025.03.14.643404. https://doi.org/10.1101/2025.03.14.643404

(2) Testa, A.; Hughes, S. J.; Lucas, X.; Wright, J. E.; Ciulli, A. Structure-Based Design of a Macrocyclic PROTAC. Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 1727–1734. https://doi.org/10.1002/anie.201914396