电压门控性钙通道α2δ亚基-1调控结肠癌进展并影响其微环境

CACNA2D1 regulates the progression and influences the microenvironment of colon cancer

Keywords: CACNA2D1; Colon cancer; Fibroblast; Voltage-gated calcium channel; p53.

近年来，由于化疗的进步和分子靶向药物的出现，结肠癌（CC）的治疗结果有所改善。离子转运体（Ion transporters）在细胞功能中起着至关重要的作用，近年来作为癌症的潜在治疗靶点而受到关注。阐明基因和蛋白质在癌症微环境中的功能是引起广泛关注的研究领域，因此，肿瘤与基质之间的关系以及肿瘤细胞与成纤维细胞之间的相互作用在癌症调控中的重要作用值得深入探讨。

电压门控钙离子通道（Voltage-gated Calcium Channels，VGCCs）是由 4-5 个亚基组成的复合蛋白。电压门控性钙通道α2/δ亚基-1（CACNA2D1）编码 alpha2/delta 亚基家族的成员，是电压依赖性钙通道复合体中的一种蛋白质，已被报道为几种癌症的致癌基因。然而，其在 CC 中的功能尚不清楚，且与癌症微环境之间的关系也尚未见报道。

鉴于此，日本京都府立医科大学消化外科的课题组在最近的研究中探讨了钙通道对癌症的作用，阐释了 CACNA2D1 在调控 CC 患者肿瘤进展中的作用及其临床病理意义，还讨论了 CACNA2D1 表达与基质之间的关系及其对癌症微环境的影响。研究表明，CACNA2D1 在肿瘤进展中起着至关重要的作用，并影响结肠癌患者的微环境。研究成果发表在 Journal of Gastroenterology 期刊题为“CACNA2D1 regulates the progression and influences the microenvironment of colon cancer”。

IHC 分析显示，癌变区域的染色强度根据CACNA2D1表达水平而变化。CACNA2D1 高表达与高度分化程度的肿瘤相关。高CACNA2D1表达组的 5 年无复发生存率和5 年总生存率（OS）显著低于CACNA2D1低表达组，证实了CACNA2D1高表达组的 CC 患者预后较差。

利用 RT-PCR 和 Western Blotting 分别检测8 株 CC 细胞系中 CACNA2D1 的基因和蛋白表达。结果表明，每个 CC 细胞系均表达 CACNA2D1，并选择CACNA2D1高表达的HCT116、RKO和SW480细胞进行随后实验。

转染CACNA2D1 siRNA后48或72 h，HCT116、RKO和SW480细胞的数量显著低于转染对照siRNA的细胞（图1 a）。增殖测定结果显示，CACNA2D1 缺失的 HCT116、RKO 和 SW480 细胞的吸光度显著低于对照细胞（图1 b）。细胞周期分析显示，与对照细胞相比，CACNA2D1 缺失的 HCT116 和 RKO 细胞中处于 sub-G1 期的细胞数量增加（图1 c）。这些结果表明，CACNA2D1 调节 CC 细胞的增殖和细胞周期。

siRNA 转染后 72 h，CACNA2D1缺失的 HCT116、RKO 和 SW480 细胞中早期（膜联蛋白V-阳性和 PI-阴性）和晚期凋亡细胞（膜联蛋白V-阳性和 PI-阳性）的比例显著高于用对照细胞（图1 d）。这表明，CACNA2D1 会调控 CC 细胞的凋亡。伤口愈合试验分析显示，与对照细胞相比，CACNA2D1 缺失的 HCT116 和 RKO 细胞的迁移受到显著抑制（图1 e），这说明，CACNA2D1 也调控 CC 细胞的迁移。

此外，还分析了 CACNA2D1 特异性抑制剂氨氯地平（amlodipine）对 HCT116 和 RKO 细胞的抑制和细胞毒性作用，结果在两种细胞系中均观察到细胞毒性，且氨氯地平处理的 HCT116 和 RKO 细胞的早期和晚期细胞凋亡增加。

图1 CACNA2D1调节结肠癌（CC）细胞的增殖、细胞周期、凋亡和迁移。

接下来，进行了共培养实验（图2 a）分析 CACNA2D1 对 CC 细胞系中成纤维细胞迁移的影响。结果发现，与阴性对照 HCT116 和 RKO 细胞相比，CACNA2D1缺失的 HCT116 和 RKO 细胞的成纤维细胞迁移受到显著抑制（图2 c）。这提示，CC 中的 CACNA2D1 可能调控成纤维细胞迁移并影响微环境。

敲低CACNA2D1后发现，与阴性对照 HCT116 细胞培养基中释放的转化生子因子（TGFB1）和血小板源性生长因子（PDGF-BB）相比，CACNA2D1缺失的 HCT116 培养基的释放水平降低（图2 d）。这说明，CACNA2D1调控 CC 细胞分泌的 TGFB1 和 PDGF-BB水平。

进一步利用共培养系统（图2 b）研究 CACNA2D1 敲低是否会改变 CC 细胞系中的成纤维细胞增殖，发现 CACNA2D1 敲低并不影响 CC 细胞中的成纤维细胞增殖。

当 CC 细胞系与成纤维细胞共培养时，成纤维细胞转化为癌症相关成纤维细胞（CAF），CAF 标志物水平升高。然而，HCT116 和 RKO 细胞中的 CACNA2D1 敲低在共培养时可下调其标志物的表达，抑制了成纤维细胞向 CAF 的转化（图2 e）。

图2 CACNA2D1对成纤维细胞与癌细胞共培养的影响。

最后，利用微阵列分析阐明 CACNA2D1 缺失的 HCT116 细胞的基因表达谱。结果显示，2847 个基因上调，2832 个基因下调。生信分析IPA数据库将“cancer”和“organismal injury and abnormalities”确定为排名靠前的两种疾病，而排名靠前的两种分子和细胞功能是“cellular assembly and organization”和“cellular function and maintenance”。

IPA 确定 p53 信号通路是受 CACNA2D1 敲低影响的排名靠前的经典通路之一。此外，实验还验证了四个已知基因（TP53、FAS、caspase 6 和 BAX，图3 a）的表达水平。在CACNA2D1缺失的 HCT116 和 RKO 细胞中TP53、FAS、caspase 6 和 BAX 的 mRNA 表达显著高于阴性对照细胞（图3 c）。相反，与 EMT 相关通路相关的基因的表达下降（图3 b）。在CACNA2D1缺失的 HCT116 和 RKO 细胞中CDH1 的 mRNA 表达显著上调，而 CDH2、ZEB1、ZEB2、TGFB1、TGFBR1 和 VIM 的 mRNA 表达显著下调（图3 d）。此外，cBioPortal 数据库也揭示了CACNA2D1 与这些基因之间的密切相关性。这些数据表明，CACNA2D1调控 p53 信号通路和上皮-间充质转化（EMT）相关通路。

图3 网络分析使用微阵列分析和IPA通路分析。红色表示基因上调，绿色表示基因下调，橙色表示预期会上调的基因，蓝色表示预期会下调的基因。

综上所述，该研究显示，CACNA2D1 高表达水平与 CC 患者预后不良相关，并且基质表达水平也高。CACNA2D1 还可调控 CC 细胞的增殖、凋亡和迁移。此外，CACNA2D1 影响成纤维细胞的迁移并促进成纤维细胞向 CAFs 的转化。微阵列分析显示，CACNA2D1 改变了细胞凋亡相关和 EMT 相关基因的表达。目前的结果揭示了 CACNA2D1 在 CC 中的功能，表明其有潜力作为CC肿瘤生长的生物标志物和有希望的CC治疗靶点。

参考文献：Inoue H, Shiozaki A, Kosuga T, Shimizu H, Kudou M, Arita T, Konishi H, Komatsu S, Kuriu Y, Kubota T, Fujiwara H, Morinaga Y, Konishi E, Otsuji E. CACNA2D1 regulates the progression and influences the microenvironment of colon cancer. J Gastroenterol. 2024 Jul;59(7):556-571. doi: 10.1007/s00535-024-02095-x. Epub 2024 Mar 27. PMID: 38536483.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38536483/

Journal Impact Factor 6.9 (2023)

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