Vaspin靶向AMPK信号通路通过GRP78受体减轻脂肪变性诱导的纤维化
非酒精性脂肪性肝病 （NAFLD） 是一种多因素疾病，通常与肥胖、2型糖尿病（T2D）、高脂血症和代谢综合征有关。虽然参与NAFLD发展的确切分子机制尚不清楚，但肝细胞FFA（游离脂肪酸）积累和脂毒性与几个基因功能有关，这些基因功能增加FFA摄取（如Caveolin-1和FABP4）和脂肪生成（如FAS，SCD-1和SREBP-1c）并减少脂肪酸β-氧化（如CPT1和MCAD）和分泌（如apoB100）。已经证明，Caveolin-1 和 FABP4 蛋白水平与脂肪变性、炎症和纤维化的严重程度相关。SREBP1c是成脂基因（包括FAS）表达的主要转录因子，在维持静息状态的肝星状细胞（HSC）的纤维化机制中起主要作用。CPT1位于线粒体外膜，促进脂肪酸进入线粒体进行β-氧化并降低CPT1，导致ROS生成和炎症。此外，apoB100是肝细胞VLDL（极低密度脂蛋白）分泌和维持脂质稳态的关键成分。
这些基因的表达水平主要受 5′ AMP 活化蛋白激酶 （AMPK） 活性的影响。增加细胞AMP/ATP比值刺激AMPK磷酸化，抑制脂肪酸（FA）的重新合成，激活FA氧化，并通过抑制细胞因子诱导的核因子-κB（NF-κB）的产生来诱导抗炎作用。已有研究表明，含pyrin结构域NOD样受体家族3（NLRP3）的炎症小体的激活与肝脂肪变性的进展密切相关。NLRP3炎症小体无疑是代谢炎症和肝纤维化的重要介质。
内脏脂肪组织来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂（vaspin）是由脂肪细胞、肝细胞和其他几种组织释放的脂肪因子，由于其改善胰岛素抵抗和抗动脉粥样硬化的能力而受到广泛关注，它在激活各种信号通路中起主要作用。Vaspin可作为内皮细胞和卵巢细胞以及活化的蛋白激酶A（PKA）信号通路中GRP78受体的配体。也有报道称，vaspin与肝脂肪变性以及纤维化进展密切相关。
鉴于没有关于vaspin对脂肪变性和肝纤维化发展中细胞代谢影响的分子机制研究，伊朗库尔德斯坦医科大学研究团队曾试图详细阐明vaspin对相关基因、信号通路和炎症标志物表达的可能影响，还使用具有HepG2（人肝癌细胞系）和LX-2（人肝星形细胞）细胞系的NAFLD细胞模型研究了纤维化相关过程。
细胞内脂质积累和细胞活力测定
为了研究脂肪变性的细胞模型，使用荧光显微镜和流式细胞术观察并确认了FFA积累。结果表明，与对照组相比，细胞内FFA含量增加了（27.9%）。然后使用MTT测量FFA处理的细胞的活力以及HepG2细胞的vaspin的活性。结果表明，在用 1.2 mM FFA 和 50、100 和 300 ng/ml vaspin 处理的细胞中未观察到与处理相关的细胞死亡。在共培养的HepG2 + LX-2细胞系中也观察到了类似的结果。
vaspin对FFA处理的HepG2细胞系中Caveolin-1、FABP4和apoB100基因表达的影响
Vaspin改变了FFA处理的HepG2细胞系中Caveolin-1、FABP4和apoB100的表达水平。图1显示，与未处理组相比，FFA处理的细胞中基因表达显著增加。24 小时后，vaspin（50、100、300 ng/ml）显著降低Caveolin-1表达，并降低FABP4基因表达，但这些变化不显著。apoB100的表达水平较对照组显著升高。用1:2000稀释的GRP78-Ab溶液处理细胞从而抑制GRP78受体，这显著阻断了三种浓度下vaspin对Caveolin-1和apoB100表达水平的影响。
图1 50、100、300 ng/ml vaspin处理和阻断GRP78受体对相关FA摄取和分泌基因表达的影响。Vaspin降低了FFA处理的HepG2细胞系中的Caveolin-1，apoB100表达。通过单独RT-qPCR并与FFA处理的HepG2细胞系中的GRP78-Ab共处理24 h 分析Vaspin对Caveolin-1，FABP4和apoB100基因表达的影响。
Vaspin降低了FFA处理的HepG2细胞系中的SCD-1、FAS和SREBP-1c表达
接下来实验评估了参与脂肪生成的SCD-1，FAS和SREBP-1c的基因表达。FFA处理24小时后，3种基因的表达水平均显著升高。与对照组相比，用vaspin处理逆转了SCD-1，SREBP-1c（在所有三种浓度下）和FAS（100 ng/ml）的这种表达。
与vaspin 相同浓度的处理相比，vaspin与GRP78-Ab的联合处理显著逆转了SCD-1和SREBP-1c表达的降低。在FAS基因表达中，与相同浓度的vaspin单独处理相比，同时用vaspin和GRP78-Ab处理细胞没有观察到显著增加。
Vaspin增加了FFA处理的HepG2细胞系中的CPT1和MCAD表达
为了研究vaspin抑制肝脏脂肪变性的机制，实验测量了参与肝β-氧化的关键基因的表达，包括CPT1和MCAD。FFA处理24小时后CPT1和MCAD基因表达下降，对MCAD有统计学意义。所有浓度的vaspin均显著增加MCAD的表达，而100 ng/ml浓度显著增加CPT1的表达。但是当细胞同时用vaspin和GRP78-Ab处理时，这些表达的升高在CPT1（100 ng/ml 下）和MCAD（所有浓度下）中得到显著抑制（图2）。
图2 Vaspin增加FFA处理的HepG2细胞系中CPT1和MCAD基因的表达。通过RT-qPCR 分析并与FFA 处理的 HepG2 细胞系中 GRP78 Ab 共处理24 h 分析50、100、300 ng/ml vaspin 对CPT1和 MCAD 基因的影响。
Vaspin在FFA处理的HepG2中增加AMPK活性
实验还研究了vaspin对AMPK活性的刺激作用。与对照组相比，浓度为50、100和300 ng/ml的vaspin处理的细胞在24小时内显著增加AMPK活性。与相同浓度的vaspin相比，用vaspin和GRP78-Ab共同处理细胞抑制了这种升高，并在50和100 ng/ml浓度下显著降低了AMPK的活性。
Vaspin降低了HepG2和LX-2细胞系共培养纤维化模型中NF-κB和TGF-β1的表达
与FFA处理的细胞相比，FFA和100 ng/ml vaspin同时处理共培养的HepG2和LX-2细胞显著降低了NF-κB和TGF-β1表达（图3 a、b）。与FFA处理的细胞相比，MCC950（NLRP3抑制剂）处理组NF-κB和TGF-β1的基因表达也降低（图3 a、b）。值得注意的是，vaspin在降低TGF-β1表达方面比MCC950更有效（图3 b）。研究发现，与vaspin和MCC950组的个体效应相比，vaspin和MCC950的共同处理显著降低了TGF-β1和NF-κB的基因表达。这表明vaspin+MCC950具有协同作用（图3 a、b）。
图3 Vaspin降低了FFA处理的HepG2和LX-2细胞系中的NF-κB和TGF-β1基因表达。通过RT-qPCR分析MCC950，100 ng/ml vaspin和vaspin+MCC950对HepG2和LX-2共培养细胞中NF-κB和TGF-β1基因的影响。
Vaspin降低了HepG2和LX-2细胞系共培养纤维化模型中TGF-β1和α-SMA的蛋白质水平
与各自的对照组相比，Vaspin（100 ng/ml）显著降低了FFA处理（96小时）的共培养的HepG2和LX-2细胞中TGF-β1和α-SMA的蛋白质水平（图4 b、c）。同样，与FFA处理组相比，MCC950处理组的TGF-β1和α-SMA蛋白显著减弱。这一结果表明，与MCC950相比，vaspin在降低TGF-β1方面比α-SMA具有更强的潜在作用。
图4 Vaspin可减轻共培养的FFA处理的HepG2和LX-2细胞系中的肝纤维化。HepG2和LX-2共培养的细胞用MCC950，100 ng/ml vaspin 和vaspin+MCC950处理。通过蛋白质印迹分析TGF-β1和α-SMA蛋白水平。
总之，该研究的数据首次表明，vaspin减少了细胞模型中的炎症和纤维化。实验观察到，vaspin通过降低参与脂肪生成和FA摄取的基因表达，同时通过GRP78受体和AMPK信号通路增加氧化和FA分泌，从而减少了肝细胞中的FA积累。这表明 vaspin 可被视为肝纤维化的潜在抗脂肪变性和抗纤维化剂。
参考文献：Abdolahi A, Vahabzadeh Z, Izadpanah E, Moloudi MR. Vaspin attenuates steatosis-induced fibrosis via GRP78 receptor by targeting AMPK signaling pathway. J Physiol Biochem. 2022 Feb;78(1):185-197. doi: 10.1007/s13105-021-00852-7. Epub 2022 Jan 10. PMID: 35001345.
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这些基因的表达水平主要受 5′ AMP 活化蛋白激酶 （AMPK） 活性的影响。增加细胞AMP/ATP比值刺激AMPK磷酸化，抑制脂肪酸（FA）的重新合成，激活FA氧化，并通过抑制细胞因子诱导的核因子-κB（NF-κB）的产生来诱导抗炎作用。已有研究表明，含pyrin结构域NOD样受体家族3（NLRP3）的炎症小体的激活与肝脂肪变性的进展密切相关。NLRP3炎症小体无疑是代谢炎症和肝纤维化的重要介质。
内脏脂肪组织来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂（vaspin）是由脂肪细胞、肝细胞和其他几种组织释放的脂肪因子，由于其改善胰岛素抵抗和抗动脉粥样硬化的能力而受到广泛关注，它在激活各种信号通路中起主要作用。Vaspin可作为内皮细胞和卵巢细胞以及活化的蛋白激酶A（PKA）信号通路中GRP78受体的配体。也有报道称，vaspin与肝脂肪变性以及纤维化进展密切相关。
鉴于没有关于vaspin对脂肪变性和肝纤维化发展中细胞代谢影响的分子机制研究，伊朗库尔德斯坦医科大学研究团队曾试图详细阐明vaspin对相关基因、信号通路和炎症标志物表达的可能影响，还使用具有HepG2（人肝癌细胞系）和LX-2（人肝星形细胞）细胞系的NAFLD细胞模型研究了纤维化相关过程。
细胞内脂质积累和细胞活力测定
为了研究脂肪变性的细胞模型，使用荧光显微镜和流式细胞术观察并确认了FFA积累。结果表明，与对照组相比，细胞内FFA含量增加了（27.9%）。然后使用MTT测量FFA处理的细胞的活力以及HepG2细胞的vaspin的活性。结果表明，在用 1.2 mM FFA 和 50、100 和 300 ng/ml vaspin 处理的细胞中未观察到与处理相关的细胞死亡。在共培养的HepG2 + LX-2细胞系中也观察到了类似的结果。
vaspin对FFA处理的HepG2细胞系中Caveolin-1、FABP4和apoB100基因表达的影响
Vaspin改变了FFA处理的HepG2细胞系中Caveolin-1、FABP4和apoB100的表达水平。图1显示，与未处理组相比，FFA处理的细胞中基因表达显著增加。24 小时后，vaspin（50、100、300 ng/ml）显著降低Caveolin-1表达，并降低FABP4基因表达，但这些变化不显著。apoB100的表达水平较对照组显著升高。用1:2000稀释的GRP78-Ab溶液处理细胞从而抑制GRP78受体，这显著阻断了三种浓度下vaspin对Caveolin-1和apoB100表达水平的影响。
Vaspin降低了FFA处理的HepG2细胞系中的SCD-1、FAS和SREBP-1c表达
接下来实验评估了参与脂肪生成的SCD-1，FAS和SREBP-1c的基因表达。FFA处理24小时后，3种基因的表达水平均显著升高。与对照组相比，用vaspin处理逆转了SCD-1，SREBP-1c（在所有三种浓度下）和FAS（100 ng/ml）的这种表达。
与vaspin 相同浓度的处理相比，vaspin与GRP78-Ab的联合处理显著逆转了SCD-1和SREBP-1c表达的降低。在FAS基因表达中，与相同浓度的vaspin单独处理相比，同时用vaspin和GRP78-Ab处理细胞没有观察到显著增加。
Vaspin增加了FFA处理的HepG2细胞系中的CPT1和MCAD表达
为了研究vaspin抑制肝脏脂肪变性的机制，实验测量了参与肝β-氧化的关键基因的表达，包括CPT1和MCAD。FFA处理24小时后CPT1和MCAD基因表达下降，对MCAD有统计学意义。所有浓度的vaspin均显著增加MCAD的表达，而100 ng/ml浓度显著增加CPT1的表达。但是当细胞同时用vaspin和GRP78-Ab处理时，这些表达的升高在CPT1（100 ng/ml 下）和MCAD（所有浓度下）中得到显著抑制（图2）。
Vaspin在FFA处理的HepG2中增加AMPK活性
实验还研究了vaspin对AMPK活性的刺激作用。与对照组相比，浓度为50、100和300 ng/ml的vaspin处理的细胞在24小时内显著增加AMPK活性。与相同浓度的vaspin相比，用vaspin和GRP78-Ab共同处理细胞抑制了这种升高，并在50和100 ng/ml浓度下显著降低了AMPK的活性。
Vaspin降低了HepG2和LX-2细胞系共培养纤维化模型中NF-κB和TGF-β1的表达
与FFA处理的细胞相比，FFA和100 ng/ml vaspin同时处理共培养的HepG2和LX-2细胞显著降低了NF-κB和TGF-β1表达（图3 a、b）。与FFA处理的细胞相比，MCC950（NLRP3抑制剂）处理组NF-κB和TGF-β1的基因表达也降低（图3 a、b）。值得注意的是，vaspin在降低TGF-β1表达方面比MCC950更有效（图3 b）。研究发现，与vaspin和MCC950组的个体效应相比，vaspin和MCC950的共同处理显著降低了TGF-β1和NF-κB的基因表达。这表明vaspin+MCC950具有协同作用（图3 a、b）。
Vaspin降低了HepG2和LX-2细胞系共培养纤维化模型中TGF-β1和α-SMA的蛋白质水平
与各自的对照组相比，Vaspin（100 ng/ml）显著降低了FFA处理（96小时）的共培养的HepG2和LX-2细胞中TGF-β1和α-SMA的蛋白质水平（图4 b、c）。同样，与FFA处理组相比，MCC950处理组的TGF-β1和α-SMA蛋白显著减弱。这一结果表明，与MCC950相比，vaspin在降低TGF-β1方面比α-SMA具有更强的潜在作用。
总之，该研究的数据首次表明，vaspin减少了细胞模型中的炎症和纤维化。实验观察到，vaspin通过降低参与脂肪生成和FA摄取的基因表达，同时通过GRP78受体和AMPK信号通路增加氧化和FA分泌，从而减少了肝细胞中的FA积累。这表明 vaspin 可被视为肝纤维化的潜在抗脂肪变性和抗纤维化剂。
参考文献：Abdolahi A, Vahabzadeh Z, Izadpanah E, Moloudi MR. Vaspin attenuates steatosis-induced fibrosis via GRP78 receptor by targeting AMPK signaling pathway. J Physiol Biochem. 2022 Feb;78(1):185-197. doi: 10.1007/s13105-021-00852-7. Epub 2022 Jan 10. PMID: 35001345.
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