气相色谱- 三重四极杆质谱联用技术测定农药残留的方法验证

Laszlo Hollosi, Katerina Bousova, Michal Godula

赛默飞世尔科技, 食品安全应用中心，德国Dreieich

 

TraceFinder，TSQ8000，气相色谱，GC，GC-MS/MS，农药残留，QuEChERS，三重四极杆

 

 

食品中农药残留的分析是实验室日常工作中最重要和最具挑战性的任务之一。欧洲法规规定了植物和动物来源的各种产品中农药的最大残留限量（MRL），是目前世界上最严格的法规（欧洲法规396/2005 和指令2006/125/EC）。这些法规要求一些特定的食品基质有很低的定量检出限（LOQ），针对这些基质的分析是一个很大的挑战。目前已经有各种各样的GC 和HPLC 方法结合各种样品前处理和净化技术用于多种农药残留的测定。近年来，QuEChERS方法被广泛的应用在水果和蔬菜的样品前处理，但是随着对测定方法的灵敏度和准确度的要求越来越高，同样需要仪器生产厂商不断进步。

 

本文方法中样品前处理采用QuEChERS 试剂盒，样品测定采用最新开发的Thermo ScientificTM TSQTM 8000 PesticideAnalyzer 系统，并采用Thermo ScientificTM TraceFinderTM 软件进行快速的数据分析。本文介绍了完整的多农药残留的测定方法的内部方法验证结果，以及对方法性能参数的评估。

 

本方法验证研究的目的是证明一种能应用在一些有代表性的基质（草莓、小麦粉和韭菜）中的多农药残留（大约140 种优先的农药）的日常分析的完整工作流程及解决方案（由Thermo Scientific 化学品、消耗品和仪器提供）。此方法符合现行法规的要求，方法的检出限（LOQ）与MRL 值一致，具有良好的灵敏度1-4。

 

取出部分事先均质好的样品（对一些不稳定的化合物，建议在低温下研磨），采用标准的QuEChERS 方法（萃取和净化）进行样品前处理，然后进样到TSQ 8000 Triple-Stage Quadrupole GC-MS/MS 系统5,6。

现成的QuEChERS 试剂盒包括萃取管和净化管， 以及相关的样品前处理操作方法（赛默飞世尔科技，英国Runcorn）。农药残留的鉴定是基于保留时间，并用特征离子对在选择反应监测（SRM）模式下的离子比进行验证，而定量采用的是基质匹配校准曲线和内标法。所有的方法性能标准是根据相关的指导方针而设定的1-4,7。

 

所有单个的农药化合物均购自Sigma-Aldrich® ( 德国) 和Laboratory Instruments Srl ( 意大利CASTELLANA GROTTE)，包括乙酰甲胺磷、氟丙菊酯、双甲脒、保棉磷、嘧菌酯、联苯菊酯、联苯三唑醇、啶酰菌胺、溴螨酯、溴菌唑、乙嘧酚磺酸酯、噻嗪酮、硫线磷、克菌丹、西维因、克百威、萎锈灵、虫螨腈、毒虫畏、乙酯杀螨醇、百菌清、氯苯胺灵、乙基毒死蜱、甲基毒死蜱、氟氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、环丙唑醇、嘧菌环胺、滴滴滴、滴滴伊、滴滴涕、溴氰菊酯、甲基内吸磷、二嗪磷、苯氟磺胺、氯硝胺、二氯二苯甲酮、敌敌畏、开乐散、苯醚甲环唑、乐果、烯酰吗啉、二苯胺、硫丹、硫丹硫酸盐、苯硫磷、氟环唑、乙硫磷、灭线磷、醚菊酯、苯线磷、苯线磷砜、苯线磷亚砜、氯苯嘧啶醇、腈苯唑、杀螟硫磷、苯氧威、甲氰菊酯、苯锈啶、丁苯吗啡、倍硫磷、氰戊菊酯、氟虫腈、咯菌腈、氟喹唑、氟硅唑、氟酰胺、粉唑醇、氟胺氰菊酯、灭菌丹、α- 六六六，β- 六六六，γ- 六六六（林丹）、己唑醇、抑霉唑、异菌脲、甲基异柳磷、醚菌酯、利谷隆、马拉硫磷、嘧菌胺、甲霜灵、虫螨畏、甲胺磷、杀扑磷、灭虫威、嗪草酮、久效磷、腈菌唑、邻苯基苯酚、噁草酮、噁霜灵、多效唑、甲基对氧磷、对硫磷（乙基）、甲基对硫磷、二甲戊灵、氯菊酯、稻丰散、伏杀硫磷、亚胺硫磷、磷胺、抗蚜威、对脱甲基抗蚜威、甲基嘧啶磷、咪酰胺、腐霉利、丙溴磷、炔螨特、丙环唑、炔苯酰草胺、丙硫磷、唑菌胺酯、哒螨灵、嘧霉胺、吡丙醚、喹氧灵、螺螨酯、戊唑醇、虫酰肼、吡螨胺、七氟菊酯、四氟醚唑、三氯杀螨砜、四氢酞酰亚胺、噻苯咪唑、甲基立枯磷、甲苯氟磺胺、三唑酮、三唑醇、肟菌酯、氟乐灵、灭菌唑、乙烯菌核利。

 

6.2 内标物

1- 溴-4- 氟苯（BFB）和磷酸三苯酯（TPP）（购自Sigma-Aldrich，德国）。

 

6.3 质量控制材料

FAPAS #19140QC ( 生菜), FAPAS #19141QC ( 青刀豆) 和FAPAS#19142QC ( 瓜泥)。

注意：FAPAS 样品的选择主要是基于目标农药成分的含量。但是由于样品有限，选择的基质与验证的基质稍有不同。

 

7.1 单个农药标准储备液

在十万分之一分析天平上称取每种农药单标化合物10 mg，分别倒入到20 mL 棕色螺口带盖样品瓶中，加入10 mL 相应的溶剂（根据不同的化合物加入丙酮、甲苯或者乙腈）溶解，配制成浓度为~ 约1000 mg/L 的溶液。每种单个标准储备液的浓度根据称样量和加入溶剂的体积计算得到。所有单标储备液在-20℃冰箱中冷冻保存。单标储备液的有效期为6 个月。

 

7.2 中间标准储备液和工作标准溶液

移取适量的单标储备液，用乙腈稀释。中间标准储备液的浓度为5000 ng/mL。进一步稀释配制得到工作标准溶液。中间标准储备液在-20℃冰箱中冷冻保存，工作溶液保存在4℃冰箱中。中间储备液的有效期为3 个月。

 

7.3 单个内标物储备液

在十万分之一分析天平上称取每种农药单标化合物10mg，分别倒入到20 mL 棕色螺口带盖样品瓶中，加入10mL 丙酮到TPP 中，加入10 mL 甲苯到BFB 中，配制成浓度为~1000 mg/L 的溶液。溶液的准确浓度根据称样量和加入溶剂的体积计算得到。所有单个内标物储备液在-20℃冰箱中冷冻保存。单个内标物储备液的有效期为6 个月。

 

7.4 内标物工作标准储备液

分别移取适量的单个标准储备液，用乙腈稀释。内标物工作标准储备液的浓度为5000 ng/mL，可直接用于样品的加标。工作储备液的有效期为3 个月。

 

7.5 1% 山梨醇溶液（分析物保护剂）

在体积比为70/30% 的乙腈/ 水溶液中配制，进样前加入样品中。进样前加入保护剂溶液的目的是防止分析物的交互反应和进样过程中的损失8。

 

 

 

 

11.1 样品前处理

用于方法验证实验的空白基质样品 （草莓（SB），小麦粉（WF）和韭菜（LK））购自当地零售商店。在样品前处理前，将空白基质样品在Ultra-Turrax 均质器上均质处理、提取和净化。基质提取物用于基质空白样品，稀释溶剂用于基质匹配校准。样品前处理采用现成的Thermo Scientific QuEChERS萃取试剂盒，包括4 g MgSO4，1 g NaCl，1 g 无水柠檬酸三钠和0.5 g 柠檬酸二钠组成的缓冲剂，用于目标化合物的萃取。预先准备好的净化管含有1200 mg MgSO4，400 mg PSA 和400mg C18，用于提高更复杂的样品基质的净化效率，如韭菜。所有的样品基质采用同样的QuEChERS 方法。

 

11.1.1 样品基质的均质

11.1.1.1 选取较大量的草莓（约500 g）和一把韭菜基质，加入到适当大小的烧杯中，贴上标签。

11.1.1.2 在Ultra-Turrax 均质器上装上G25 解胶工具。（建议一些不稳定的化合物采用冷冻均质以提高回收率。）

11.1.1.3 中等速度（速度水平2-3）下开始均质，直到形成光滑的匀浆。

11.1.2 样品萃取和净化

11.1.2.1 称取10 g 样品到50 mL QuEChERS 萃取管中。萃取管中含有4 g MgSO4，1 g NaCl，1 g 无水柠檬酸三钠和0.5 g 柠檬酸二钠。

11.1.2.2 在样品中加入200 μL 5000 ng/mL 的内标物#141。

11.1.2.3 在SB 和LK 样品中加入10 mL ACN。对于WF 样品，先加20 mL 水使样品完全湿润，然后加入10 mL ACN。

11.1.2.4 样品在水平震荡仪上震荡10 min，然后在5000rpm 转速下离心5 min。将上清液（约8 mL）转移到15 mL QuEChERS 净化管，净化管中包括1200 mg MgSO4，400 mg PSA 和400 mg C18。

11.1.2.5 旋涡震荡样品1 min，然后在5000 rpm 转速下离心5 min。

11.1.2.6 收集上清液，取1 mL 加入到GC 进样瓶中，用于仪器分析。

11.1.2.7 进样前在样品瓶中加入50μL 山梨醇溶液（保护剂）和20 μL 5000 ng/mL 进样标准溶液（BFB）。

 

样品测定采用TRACE 1310 气相色谱与TSQ 8000 三重四极杆质谱仪联用技术（农药残留分析手册）。仪器控制、数据采集、数据处理和报告采用TraceFinder 3.1 软件。

 

11.2.1 GC 方法设置

进样器参数设置如下：

 

 

表1. GC 程序升温设置

 

11.2.2 三重四极杆MS 设置

质谱检测使用TSQ 8000 三重四极杆质谱仪的Timed-SRM 模式完成。所有的方法和SRM 设置来自Thermo Scientific TSQ8000 Pesticide Analyzer 系统6。离子比值根据每种待测基质进行修改和设置。

 

参数设置如下：

 

目标农药的定量采用内标法。相对响应因子（Rf）的定义见如下列方程。按照如下方程计算最终结果。

 

11.3.1 方程

响应因子的计算：

 

Rf – 相对响应因子

Ast – 校准标样中农药的峰面积

A[IS] – 校准标样中内标物的峰面积

Cst – 校准标样溶液中农药的浓度

C[IS] – 校准标样溶液中内标物的浓度

 

样品含量的计算（样品中农药的绝对量）：

 

样品含量的计算（样品中农药的绝对量）：

 

 

校准曲线建立在六个浓度水平上（基质匹配），每个浓度平行进样两次。根据所有基质和内标物的校准曲线，在整个校准范围内计算了累加平均响应因子做为内标的Rf 值。校准浓度范围分别为0-200，0-1000 和0-2000 ng/g 的三组化合物（取决于相关MRL 值）分别制备了校准曲线（具体结果见表3）。校准标样浓度水平的选取为校准曲线范围内等距离分布。线性函数采用曼德尔拟合方法，曲线残差应小于可接受限的20%3。此外，由于没有相关法规的规定，将相关系数值的最低限设定为0.985。由于与校准标样浓度水平相关的LOQ 值太高，设定标准不适合甲氰菊酯和苯氟磺胺（LK），以及炔螨特（WF）。没有采用加权函数。

 

基质效应采用尤登图进行评估，以配制在溶剂中和相关基质中的校准标样的相对峰面积测定值作图。如果拟合线性与理想曲线（y=x）斜率的差别（dif%）小于20%，则认为没有基质效应；当差别在20-50% 之间时，有较小基质效应；当差别超过50%，有较大基质效应。基质效应的结果如表3 所示。对于已证明有基质效应的化合物，要求采用基质匹配校准曲线。

 

方法的准确度用回收率实验进行评估，在空白基质中加入三个浓度水平的标样（L1，L2 和L3），每个浓度平行配制并进样六次（表4）。在样品前处理之前加入标样。计算得到测定浓度、回收率和相对标准偏差（%RSD）如表5 所示。根据SANCO 的要求，回收率在70-120% 之间被认为是可以接受的3。只有加标的浓度水平高于基质中化合物的LOQ 时才计算回收率。由于加标浓度水平比LOQ值更低，没有得到WF 中的双甲脒和LK 基质中的克菌丹、百菌清和甲苯氟磺胺的回收率值。一些情况下，基质对结果有很大影响，由于不同基质测定的LOD/LOQ 值有所差别，有一到两个加标浓度下没有得到回收率值（详见表4）。对于日常测定这些基质中的这几个化合物，则需要采用其余的方法，特别是优化的分析方法。采用从FAPAS（英国约克郡）获得的外部质量控制材料确定方法偏差。这些FAPAS 材料包括#19140QC（生菜泥），#19141QC（青刀豆泥）和#19142QC（瓜泥）。这些材料只代表一定数量的目标化合物和含有这些化合物的不同基质。但是，除了克百威的测定值稍低于标准范围，其余所有情况下的测定都很好的符合规定值。这可能是由于两种不同基质特性的差异引起的。FAPAS 测定值详见表7。

 

将低浓度的标样溶液（L1）连续进样（n=6）测定所有目标化合物的保留时间和峰面积，计算得到仪器的进样精密度。在没有内标补偿的情况下，所有化合物的仪器进样精密度测定中，保留时间低于0.5%，峰面积在1.2-18.04%之间（氟虫腈和苯线磷亚砜），显示了可靠的仪器性能。连续三天测定分别配制的中等加标浓度（L2）的各个基质样品（n=6），得到方法的日内和日间精密度值，用%RSD表示。取三天内每天测定结果的平均精密度的平均值做为平均日内精密度，而日间精密度则为所有精密度数据的平均值。按照SANCO 的要求，所有的目标化合物和基质的精密度的可接受标准为<20%3。精密度测定值见表5。

 

按照IUPAC 方法测定检出限和定量检出限。方法LOD 和LOQ 的测定值，以及相关法规限值（MRLs）如表6 所列7。对于没有法规规定MRL 值的化合物，将MRL 目标值设定为10 ng/g。绝大多数目标化合物都符合MRL 值，至少与LOQ 值一样的要求。灭虫威（WF，LK）、克百威（SW）、噁霜灵（WF）和炔螨特（WF，LK）的LOQ 值超出MRL 值要求。但是，交换定量和定性离子也能达到目标值。甲氰菊酯（WF，LK），双甲脒（WF）和虫酰肼（所有基质）即使交换了定量和定性离子仍然达不到目标值。

 

耐用性实验通过改变一些参数来测定，如实验人员、提取和净化批次。结果与原方法进行对比，采用ANOVA 分析是否存在显著性差异。这些参数的变化不会导致测量值的显著性差异，显示了良好的方法耐用性。

 

本文完成了用于日常农药残留测定的方法的完整内部验证。研究的目的是客观可靠地评价一种广泛使用和接受的样品前处理方法配合先进的分析仪器的方法分析性能。方法性能参数显示大多数目标化合物的性能符合现行法规的要求。采用独立的外部质量控制材料提高了测定结果的可信赖程度。在一些情况下，由于化合物的特性和基质对分析结果的较大影响，无法确定方法性能参数或者测定值落到目标范围以外。对这些化合物（在相关基质中），必须单独优化前处理方法（额外或特殊的净化）和仪器分析方法。从实际操作上来说（特别是针对不稳定或活性化合物），可以在每40-50 次进样后更换衬管（和隔垫）以获得最佳的性能。总而言之，由赛默飞世尔科技提供的完整工作流程解决方案连同最新开发的TSQ 8000GC-MS/MS 系统为目标化合物的分析和准确定量带来了良好的系统性能，特别是在灵敏度、选择性和回收率方面。

 

1. European Commission 2002/657/EC

2. European Commission 2006/125/EC

3. European Commission SANCO/12495/2011

4. European Commission 788/2012/EC

5. Fussell et al. (2007) Food Additives & Contam, 24:1247-1256

6. Thermo Scientific TSQ 8000 Pesticide Analyzer Brochure, https://static.thermoscientific.com/images/D22018~.pdf

7. EU Pesticides Database, http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm

8. Anastassiades et al. (2003) J. Chromatogr A, 1015:163-184

 

 

表2. 目标化合物的选择性参数

 

* 所有异构体的保留时间 ** 内标化合物

 

 

表3. 线性和基质效应结果（尤登图斜率结果详见正文12.2）

 

 

表4. 10 ng/g（水平1），20 ng/g（水平2）和100 ng/g（水平3）加标浓度下的回收率值[%]

 

* 加标浓度为50,100 & 500 ng/g ** 加标浓度为100,200 & 1000 ng/g <LOD/LOQ – 加标量低于LOD/LOQ 值

 

表5. 10 ng/g（水平1），20 ng/g（水平2）和100 ng/g（水平3）浓度下的方法精密度和中间精密度值[RSD%]

 

*加标浓度为50,100 & 500 ng/g ** 加标浓度为100,200 & 1000 ng/g <LOD/LOQ – 加标量低于LOD/LOQ 值

 

表6. 方法LOD，LOQ 和现行法规规定残留限量（单位ng/g）

 

* 由于没有MRL 规定值，默认设置为10 ng/g

 

表7. 相关化合物的外部质量控制样品（FAPAS）结果

 

 

图1. 韭菜中校准浓度水平2[5 ng/g] 的甲基异柳磷的色谱图

 

 

图2. 韭菜中校准水平2[5 ng/g] 的灭线磷的色谱图

 

 

图3. 韭菜中校准水平3[10 ng/g] 的氯菊酯的两个色谱峰

 

 

图4. 小麦粉中校准水平6[100 ng/g] 的克菌丹的色谱图

 

 

图5. 小麦粉中校准水平4[25 ng/g] 的邻苯基苯酚的色谱图