双压线性离子阱质谱用于单克隆抗体分子量测定

张晓夕

赛默飞世尔科技（中国）有限公司

 

目前，在对包括癌症在内的各种疾病的诊断和治疗中，单克隆抗体（mAbs）起到了越来越重要的作用，其相关研究发展也十分迅速。不同于传统的小分子药物，单克隆抗体的结构十分复杂，存在多种异构现象，故单克隆抗体结构表征就显得尤为重要。由于生物质谱所具有的“软电离”模式和高灵敏度、高质量精度和宽动态范围等优点，在单克隆抗体分子量测定、蛋白序列测定、翻译后修饰分析及杂质分析等方面，质谱正在起到越来越重要的作用。

 

离子阱质谱经常被用于未知物的结构解析，以及常规的蛋白序列测定、翻译后修饰和糖链结构解析等。已有实验结果表明，使用LTQ Velos 离子阱质谱可以对小的完整蛋白（16kDa）进行top down 解析[1]；然而，使用离子阱质谱对150kDa 的完整单克隆抗体进行完整分子量测定尚未见报道。

 

 

在本文的研究中我们使用Velos Pro 双压线性离子阱质谱，对完整单克隆抗体及其轻重链分别进行了分子量测定。实验结果表明，离子阱质谱也能对150kDa 的完整单克隆抗体进行分子量测定，且不同糖型可得到分辨。

 

本次实验使用完整单克隆抗体样品，样品浓度2μg/μL；取部分样品上样至常规液相色谱，经在线脱盐后质谱测定其分子量；另取部分完整单克隆抗体样品经二硫苏糖醇（DTT）对二硫键还原烷基化后上样至LC-MS 系统，分别测定轻、重链分子量。

 

色谱仪：Thermo Scientific Accela 600

色谱柱：Thermo BioBasic 8 HPLC（5μm, 2.1mm, 100mm）

上样量：4μL（8μg）

流动相：A: 0.1% 甲酸水溶液，B: 0.1% 甲酸乙腈溶液梯度如下，其中前四分钟为在线除盐过程：

 

质谱仪：Velos Pro 线性离子阱质谱仪

喷雾电压：3.8 kV

毛细管温度：275 ℃

S-lens：66.8%

Scan Rate：Normal

m/z range：800-3500

In source CID：75eV

AGC target：3e5

 

数据使用ProMass 软件进行去卷积分析。

 

 

 

图1. LTQ Velos Pro 测定完整单克隆抗体分子量原始谱图

 

 

图2. 对图1 谱图进行去卷积

 

由图1 及图2 可以看出：首先，使用Velos pro 双压线性离子阱质谱对完整单克隆抗体（150kD）进行分子量测定，得到的谱图中可见不同电荷态的峰均匀分布（图1）；对其使用ProMass 软件进行去卷积分析，可知所测单克隆抗体分子量为147491Da，且不同糖型得到分辨（图2）。

 

使用DTT 对完整单克隆抗体进行还原处理后，分别对抗体的轻、重链进行分子量测定，结果如下：

 

 

图3. LTQ Velos Pro 测定单克隆抗体轻链分子量

 

 

图4. LTQ Velos Pro 测定单克隆抗体重链分子量

 

由图3 及图4 可以看出，对于DTT 处理后的单克隆抗体，分别测定其轻、重链分子量，同样可得不同电荷态的峰均匀分布的谱图；经去卷积后，分别可以得到轻、重链的分子量。其中重链部分的杂峰较多（图4），可能为不同糖型及单抗发生降解所导致。

 

在本文的研究中，我们使用Velos Pro 双压线性离子阱对完整单克隆抗体及其轻重链进行了分子量测定。结果表明：首先，对于完整单克隆抗体，离子阱质谱可以实现分子量测定并分辨出不同糖型；对于经DTT 还原后的轻、重链，离子阱质谱同样可以测定其分子量和不同糖型。离子阱质谱可满足传统定性分析需求，是未知化合物结构解析的强大武器；在蛋白质药物研究方面，被广泛用于肽图分析、序列鉴定和翻译后修饰研究等。通过本文的研究，我们证明了离子阱质谱同样可以用于单克隆抗体分子量的测定。

 

同时，由于离子阱质谱可对化合物进行多级质谱解析，在肽段的翻译后修饰研究、尤其是糖链的精细结构解析中起到不可或缺的作用。另外，双压线性离子阱Velos Pro同时具有高压和低压阱，高压阱提供最大化离子捕获、裂解和隔离效率，低压阱提供其他离子阱质谱所无法比拟的分辨率和扫描速率。综上，离子阱质谱亦为生物制药行业相关分析的有力工具。

 

[1] Tonya Pekar Second, Joshua J. Coon, Vlad Zabrouskov. A Novel Dual-Pressure Linear Ion Trap Mass Spectrometer Improves the Analysis of Complex Protein Mixtures[J]. Anal Chem. 2009 September 15; 81(18): 7757–7765.