应用Orbitrap Fusion对TMT标记样本进行MS2定量方法以及SPS MS3定量方法的比较

 

顾培明 李 静

赛默飞世尔科技（中国）有限公司

 

 

目前，蛋白质组学研究已经由传统的大规模鉴定逐步转向了靶向蛋白质组学，研究内容已经由蛋白质鉴定扩展到了蛋白质相对和绝对定量，蛋白质相对定量方法中应用最普遍的为标记定量，包括：ICAT，DIART，ICPL，TMT，iTRAQ 等等，其中又以TMT 以及iTRAQ 的应用最为广泛。

 

传统的TMT 以及iTRAQ 标记实验均使用MS² 碎片报告离子来进行定量，但是Steven P Gygi 等人发现该方法由于母离子筛选过程易受到基质干扰，因而定量结果与真实值相比偏低，而使用MS3 碎片报告离子来进行定量，则可以很好的解决这一问题，该方法的基本原理为：母离子碎裂产生的MS2 子离子用于定性，同时挑选碎片离子中强度最高的一个或者多个碎片离子，使用HCD 进行进一步的碎裂，产生的报告离子用于定量，虽然质谱在选择母离子时易受到基质的干扰，但是选择出来的母离子中绝大部分为目标母离子，因而MS2 子离子中强度较高的碎片离子绝大部分来自于目标母离子，挑选这些子离子的报告离子去做定量，定量结果会显著优于传统的应用MS2 碎片报告离子的定量方法。

本文主要介绍了赛默飞世尔新一代三合一高分辨质谱仪Orbitrap Fusion 应用SPS MS3 定量方法以及MS2 定量方法对TMT 标记样本进行定性与定量的实验，并对两种方法得到的结果进行了比较。结果显示：MS2 定量方法比SPS MS3定量方法可以鉴定并定量到更多的蛋白质，而SPS MS3 定量方法与MS2 定量方法相比可以鉴定并定量到更多低丰度的蛋白质，同时其定量结果也更加可靠。

 

 

小鼠DC 细胞系，分别进行两种不同的处理，连同对照组，抽提蛋白质，酶解，分别使用TMT 标记为127，130，131，其中对照组标记为127，标记完成后，三种标记的样本混匀，使用pH10，RP 梯度进行分级，共得16 个馏分。

 

样本使用A 液（0.1% FA，H2O）复溶，均上样4.5ul，60 min 色谱梯度分离，使用Orbitrap Fusion 对样本进行定性以及定量分析，质谱方法分别使用传统的MS2 定量方法以及SPSMS³ 定量方法。

 

2.3.1 高效液相色谱条件

高效液相色谱仪：Thermo Scientific Easy-nLC 1000

色谱柱：Easy-spray column(C18 ,3 μm, 100Å ,75 μm×15 cm)；

上样量：均4.5 μL

流动相：A: 0.1% Formic acid in water； B: 0.1% Formic acid in Acetonitrile

色谱梯度：

 

2.3.2 质谱条件

2.3.2.1 MS2 定量方法

质谱仪： Orbitrap Fusion

喷雾电压：2.1 kV

毛细管温度：275℃

S-lens：60%

碰撞能量：40% HCD

分辨率设置：一级120000@m/z 200，二级15000@m/z 200

母离子扫描范围：m/z 350-1800；子离子扫描范围：start

from m/z 100

Isolation Mode：Quadrupole

Data Dependent Mode：Top Speed

Cycle Time：3s

Exclusion Time：70s

2.3.2.2 SPS MS3 定量方法

质谱仪： Orbitrap Fusion

喷雾电压：2.1 kV

毛细管温度：275℃

S-lens：60%

Data Dependent Mode：Top Speed

Cycle Time：3s

Exclusion Time：70s

MS1： Orbitrap

分辨率：120000@m/z 200

扫描范围：m/z 400-1800

MS2: Ion Trap

Isolation Mode： Quadrupole

Activation Type： CID

Collision Energy：30%

MS3: Orbitrap

Precursor Exclusion：low：30，high:5

Number of Notches：10

Isolation Mode：Ion Trap

Activation Type：HCD

Collision Energy：65%

分辨率：30000@m/z 200

扫描范围：m/z 100-400

 

原始文件（raw file）使用Proteome Discoverer 1.4 软件搜索Uniprot_mouse.fasta 数据库( 数据库编号10090)，检索结果通过严格标准进行筛选（1% FDR）。

 

3.1.1 鉴定结果汇总

 

 

Distribution of Protein Group Identified and QuantifiedUsing MS2 Quantitation Method among 16 Samples

 

Distribution of Peptide and Unique Peptide Identified Using MS2 Quantitation Method among 16 Samples

 

由上述表格以及柱状图可以看出，在16h 小时的时间内，一共鉴定到了3022 个蛋白质，其中有2994 个蛋白质有定量信息（即131/127,130/127 均有定量结果），显示了Orbitrap Fusion 优异的定性与定量能力。

 

原始文件（raw file）使用Proteome Discoverer 1.4 软件搜索Uniprot_mouse.fasta 数据库( 数据库编号10090)，检索结果通过严格标准进行筛选（1% FDR）。

 

3.2.1 鉴定结果汇总

 

 

 

Peptide and Unique Peptide Identified Using SPS MS3 Quantitation Method among 16 Samples

 

 

Distribution of Protein Group Identified and Quantified Using SPS MS3 Quantitation Method among 16 Samples

 

由上述表格及柱状图可以看出，在16h 小时的时间内，一共鉴定到了2788个蛋白质，其中有2612 个蛋白质有定量信息（即131/127,130/127 均有定量结果），显示了Orbitrap Fusion 优异的定性与定量能力。

 

 

Protein Group Identified by Two Methods

 

 

Protein Group Quantified by Two Methods

 

由上图可以看出MS2 定量方法与SPS MS3 定量方法相比较，前者在定性与定量蛋白质数目要高于后者，由于SPS MS3 定量方法需要将母离子在IT 中碎裂后，再挑选碎片离子去做SPS MS3，因而采集速度会慢于MS2 定量方法，导致定性与定量蛋白质数目都略少。

 

此外，在样本1-7 以及样本8 中可以看出SPS MS3 定量方法可以鉴定并定量到更多的蛋白质，虽然SPS MS3 定量方法的采集速度略慢于MS2 定量方法，但是由于其蛋白质的定性是使用离子阱进行检测，其灵敏度要高于Orbitrap，而

定量报告离子是高能碎裂下的10 个碎片离子的报告离子强度总和，因而SPS MS3 定量方法与MS2 定量方法相比可以定性与定量到更多的低丰度蛋白质。

 

 

 

由上图可以看出，MS2 定量比值的log2 值绝大部分在-1与1 之间，而SPS MS3 定量比值的log2 值有部分小于-1或者大于1，与文献报道相一致，MS2 由于受到基质干扰的影响，蛋白质定量比值与真实值相比会有所差异，定量差异偏小。

 

本次实验比较了最新高分辨质谱仪Orbitrap Fusion 使用MS2 定量方法以及SPS MS3 定量方法在定性与定量蛋白质数目以及定量结果之间的差异，在16h 的总检测时间内，MS2 定量方法一共鉴定了3022 个蛋白质，其中有2994 个蛋白质有定量结果，SPS MS3 定量方法一共鉴定到了2788个蛋白质，其中有2612 个蛋白质有定量结果。从结果看，由于MS2 定量方法的扫描速度要略高于SPS MS3 定量模式的扫描速度，因而最终的结果显示前者可以鉴定并定量到更多的蛋白质，但是SPS MS3 定量方法可以鉴定并定量到更多低丰度的蛋白质，此外，由于MS2 定量方法容易受到基质干扰，定量差异偏小，结果不够准确。