ADC 单抗药物的分子量、氨基酸序列、糖基化位点以及ADC 药物结合位点鉴定

聂爱英

赛默飞世尔科技（中国）有限公司

 

Q-Exactive；ADC 单抗药物；分子量测定；氨基酸序列分析；糖基化位点分析；ADC 药物结合位点分析

 

单克隆抗体药物是具有高度特异性的靶向药物，能够特异性作用于肿瘤细胞，被誉为治疗恶性肿瘤的“生物导弹”。ADC 抗体药，则是在抗体蛋白的特定天然氨基酸上非定点偶联具有抗肿瘤作用的化疗药物（或称小分子药物），以增加单克隆抗体的疗效、并降低小分子药物的副反应。对此，研究人士表示，这相当于在“生物导弹”上精确地装上了“核弹头”，使得治疗更加安全、有效、定向。目前，在整个肿瘤药研究领域，ADC 抗体药物已得到了业内的普遍认可。不少跨国药企相继投身到 ADC 药物的研究开发中。为了保证 ADC 单抗药物的安全性和有效性，以及对单抗药物生产过程进行实时监控，对于 ADC 单抗药物的整体分子量的测定、氨基酸序列的鉴定、糖基化位点的确认、ADC 药物结合位点的确认、二硫键的定位、糖链结构的解析等重要的 ADC 药物分析指标的测试和确认，越来越受到各大制药公司的关注。目前，随着生物质谱技术的不断发展和推广，基于生物质谱的单抗分析技术也开始全面、快速的建立起来。

 

Q-Exactive 串联质谱仪结合了高选择性的四级杆质谱检测器和高分辨、高灵敏度的 Orbitrap^TM 质量分析器，大大提高了离子的选择性、灵敏度和质量精度。该系统具有 140,000 的分辨率（FWHM）、更高的灵敏度、更快的扫描速度和更大的动态范围，同时结合了 HCD 碎裂技术，可以实现串级质谱碎裂和鉴定，为深度复杂样品分析，包括蛋白质组学、代谢组学、脂类组学等样品的鉴定，翻译后修饰和定量分析，提供了全面、高效和快速的质谱分析平台。同样，Q-Exactive 质谱可以有效地应用到 ADC 单抗药物的研发和生产监控中，基本的实验分析流程如下所示。

 

图 1. 单抗分析基本流程图

 

 

2.1.1 仪器和试剂

质谱仪器：Q-Exactive（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱仪器：Accela 液相色谱系统（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱柱：Agilent Zorbax 300, SB-C8, 3 μm，2.1×50 mm ；

试剂：二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸。

 

2.1.2 仪器方法

 

色谱分析条件：具体见表 1；

质谱分析条件：具体见表 2；

 

表 1. 单抗分子量测定的色谱分析条件

流动相	A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1% 甲酸乙腈溶液
流速	300 μL/min
柱温	75℃
色谱梯度	时间/min	B相浓度/%
	0	5
	4	5
	12	90
	12.1	90
	16	90
	16.5	5
	20	5

 

表 2. 单抗分子量测定的质谱分析条件

喷雾电压	4 kV
毛细管加热温度	275℃
S-lens	60 %;
鞘气流速	30（arb）
辅助气流速	5（arb）
质量扫描范围	m/z 2000–4000
分辨率	17,500（m/z 200）
源内裂解（SID）	100 eV
Microscan	10

 

 

2.2.1 仪器和试剂

质谱仪器：Q-Exactive（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱仪器：Accela 液相色谱系统（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱柱：Thermo Scientific, C18, 100Å ,1.9 μm, 2.1×100 mm

试剂：二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸。

 

2.2.2 仪器方法

色谱分析条件：具体见表 3；

 

表 3. 氨基酸序列测定的色谱分析条件

流动相	A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1% 甲酸乙腈溶液
流速	300 μL/min
柱温	35℃
色谱梯度	时间/min	B相浓度/%
	0	5
	4	5
	45	35
	50	90
	52	90
	52.5	5
	60	5

 

质谱分析条件：具体见表 4；

 

表 4. 氨基酸序列测定的质谱分析条件

喷雾电压	3.5 kV
毛细管加热温度	275℃
S-lens	60 %;
碰撞能量	27% 归一化能量
碎裂方式	HCD
质量扫描范围	m/z 300–1800
分辨率	一级35,000（m/z 200）,
	二级17,500（m/z 200）

 

2.2.3 数据分析方法

采用 Proteome Discoverer 1.3 软件对原始谱图进行数据库搜索，具体搜库参数为：包含单抗氨基酸序列的数据库；半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）设置为固定修饰；甲硫氨酸（M）氧化（+15.995Da）、天冬酰胺（N）和谷氨酰胺（Q）脱氨基化（+0.984Da）、赖氨酸（K）ADC结合（+956.3644Da）、天冬酰胺（N）G0F糖基化（+1444.5300Da）设置为可变修饰；trypsin 设置为酶；酶漏切位点为 2。

 

 

基于高分辨质谱 Q-Exactive，为了保证采集谱图的质量和数量，我们设定 Orbitrap 检测器的采集分辨率为 17,500。经过 Q-Exactive 质谱采集的 ADC 单抗药物的原始色谱质谱总离子流图和原始质谱图如图 2 和 3 所示，我们可以观察到 ADC 抗体药物在整个质量范围内表现出均匀的电荷分布，不同电荷的质谱峰之间可以实现基线分离，从而可以判断质谱的灵敏度、分辨率和信噪比都很高。同时选取强度较高的几组质谱峰进行放大，放大之后的几组质谱峰显示相似的分布模式。

 

图 2. ADC 抗体药物色谱质谱流出图

 

 

图 3. ADC 抗体药物原始质谱图（红色虚线框内为中间几组峰的放大图）

 

经过 Protein Deconvolution 2.0 软件去卷积处理之后的单抗分子量分布图如下所示（图 4），根据单抗的氨基酸理论序列分子量进行计算，将观察到的质谱峰进行归属，从图中我们观察到，该 ADC 单抗分子之间存在 956 Da 左右的质量增加，由此推断该单抗分子结合了不同数目的分子量在 956 Da 左右的药物小分子，并且最多可以检测到 6 个药物小分子的结合。同时还观察到 160 Da 左右的质量增加，这主要是由于连接基团的存在引起的。从而初步推断该 ADC 单抗药物主要结合了 6 个 ADC 小分子药物，该结果与理论值基本一致，同时根据质谱峰的峰强度信息，我们还可以计算得到该药物的 ADR 值，该数值对于 ADC 药物的有效性评估至关重要。

 

 

图 4. Q-Exactive 质谱采集的 ADC 单抗原始质谱图经过 Protein

Deconvolution 2.0 软件去卷积处理之后的单抗分子量分布图

（D0–D6 表示不同 ADC 药物小分子结合的单抗变体，蓝色圆圈表示连接基团对应的质谱峰。）

 

3.2.1 氨基酸序列覆盖

通过 trypsin 酶解后的肽段，在 Q-Exactive 质谱上采集到的色谱质谱流出图如图 5 所示，再经过 SEQUEST 数据库搜索后，ADC 单抗重链的蛋白序列覆盖度为 90.24 %，如图 6（A）所示，轻链的蛋白序列覆盖度为 100 %，如图 6（B）所示，其中未鉴定到的氨基酸序列主要是由于缺乏酶切位点和酶切后肽段较短造成的，为了实现 100% 的氨基酸序列覆盖，可以通过选择其它内切蛋白酶来实现。

 

 

图 5. ADC 单抗药物的 Trypsin 酶解肽段的色谱质谱流出图

 

 

图6. ADC 抗体药物经过 trypsin 酶解和 Q-Exactive 质谱实现的氨基酸序列覆盖度示意图。（A 为重链氨基酸序列覆盖示意图，B 为轻链氨基酸序列覆盖示意图，其中绿色标记的氨基酸序列表示该段序列鉴定的可靠性非常高，达到 99% 以上，红色标记的氨基酸序列表示该段序列鉴定的可靠性为 95% 以下，无颜色标记的氨基酸序列表示该段序列没有被鉴定到，氨基酸序列上方的数字代表氨基酸的位置。）

 

ADC 单抗蛋白与其他单抗蛋白相同，也都包含 N-糖基化修饰，一般发生在保守序列 NXS 或 NXT 中（X 为除脯氨酸外的任意氨基酸）。在糖链完整的情况下，直接进行 trypsin 酶解，我们在搜库时进行 G0F 糖基化可变修饰设定，可以直接获得该 N 糖基化位点：重链氨基酸序列 EEQY N261STYR 中的 N261 位点，下图为该肽段的 G0F 串级质谱图，除了图中黄色和蓝色代表的该肽段的 b、y 碎片离子外，红色圆圈所示的为该糖肽的糖特征碎片离子（低 m/z 端）和糖肽碎片离子（高 m/z 端），从而可以准确确证该糖肽和糖基化位点的存在。

 

图 7. 重链氨基酸序列 EEQYN261STYR 的串级质谱图

 

根据 Proteome Discovery 软件搜库结果显示，我们发现在赖氨酸结合药物分子的肽段的串级质谱图中存在特征碎片离子 453.20、485.23 和 547.21，因此我们通过这些特征碎片对所有的可能发生 ADC 结合的肽段的串级质谱图进行人工确认，最终准确确认了轻链中 2 个赖氨酸位点和重链中 7 个赖氨酸位点发生了 ADC 小分子药物结合，具体位点如下图（图 8）所示，并且以其中一条肽段为例，给出了 ADC 结合肽段的串级质谱图（图 9），红色圈表示 ADC 特征碎片离子。同时我们也观察到 ADC 药物结合后的肽段的疏水性比较强，色谱流出比较靠后，这一现象完全符合理论推测。

 

图 8. ADC 药物小分子结合位点示意图

 

 

图 9. ADC 结合肽段 VSNKALPAPIEK 的串级质谱图

 

本文通过 Q-Exactive 质谱建立了 ADC 单抗药物的整体分子量测定、氨基酸序列鉴定、糖基化位点和 ADC 药物结合位点确认的分析方法，为 ADC 单抗药物研发分析和实时生产检测提供了高效、快速的分析平台。实验结果表明 Q-Exactive 串联质谱仪，凭借其超高的分辨率，超快的扫描速度，超高的质量精度、超低的灵敏度和超大的动态范围，极大地完善和推动了 ADC 单抗药物的鉴定分析。

 

 

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