细胞冻存保护剂工艺的优化策略：从分子机制到工艺参数的协同设计

摘要：冷冻保护剂（cryoprotective agent, CPA）是细胞低温保存的核心变量之一，但配方优化从来不是孤立命题——保护剂浓度与降温速率、植冰温度、复温方式构成一组强耦合的工艺参数。本文基于低温生物学经典理论与近年实证研究，系统梳理 CPA 的作用机制、DMSO 浓度优化的证据、非渗透性保护剂的协同设计、无 DMSO 路线的现状，并重点论述"配方—曲线联调"这一被广泛忽视的工艺原则。

1. 问题的起点：细胞不是死于"冷"，而是死于穿越温区的过程

Mazur在其经典综述中指出，细胞低温保存的核心挑战并非能否耐受 −196℃的储存，而是"细胞必须两次穿越约−15至 −60℃的致命中间温区——降温一次，复温一次"（Mazur, 1984）。这一论断奠定了整个冻存工艺设计的逻辑基础：可优化的对象不是"温度终点"，而是"穿越温区的方式"。保护剂配方与降温/复温曲线，正是决定穿越方式的两个相互耦合的工艺参数。

降温过程中存在两类方向相反的损伤机制：

（1）胞内冰损伤（IIF）：降温过快时，胞内水来不及经膜外流，超冷度持续累积，最终在成核温度（动物细胞常见 −10 至 −15℃）发生胞内结冰，冰晶机械破坏质膜、细胞器与细胞骨架，"任何可察觉的胞内冰形成几乎总是致命的"。

（2）溶液效应损伤：降温过慢时，胞外冰持续生长，未冻液通道不断收窄，细胞长时间暴露于高浓度电解质中并遭受过度脱水与机械挤压。Mazur的判别实验表明，当 85–95% 的水冻结时（未冻分数 U = 0.05–0.15），存活率"完全取决于未冻分数，而与该部分的盐浓度无关"——人红细胞在 U ≥ 0.14 时存活率超过 80%，U ≤ 0.07 时低于 20%。

两类损伤对降温速率的依赖方向相反，因此存活率与降温速率呈"倒 U 型"关系，必然存在最优速率。保护剂的作用，正是同时压制这两类损伤：一方面为细胞脱水争取时间、降低胞内冰风险，另一方面稀释未冻液、缓解溶液效应。

2. 保护剂的作用机制：四条路径与一个反直觉的要点

综合近年综述，CPA 通过四条路径发挥作用：①调节胞内溶质浓度；②降低冰点；③抑制冰晶形成与重结晶；④维持质膜流动性。CPA 通过与水分子形成广泛氢键，限制胞内水外流速率、减小胞外冰晶尺寸并缓解细胞脱水。

但一个经常被误解的要点是：渗透性保护剂的关键作用之一并非"渗进细胞里抗冻"。Mazur对甘油保护机制的重新解释是："甘油的保护作用……可能源于它以依数性方式增大了任一温度下胞外未冻液的体积，并相应降低了该体积中的盐浓度。"换言之，保护剂在胞外把未冻液"撑大"、把电解质"稀释"，从而拓宽了细胞的存活空间。这一机制解释了为什么非渗透性保护剂（羟乙基淀粉 HES、人血白蛋白、蔗糖、PVP）单独或联合使用同样有效——它们改变的是胞外的相变行为。

这一认识对工艺优化的直接含义是：配方设计不必执着于"让保护剂进细胞"，而应同时设计胞外相行为，这为渗透性/非渗透性 CPA 的组合策略提供了理论依据。

3. DMSO 浓度优化：从行业默认“10%”降到“5%”的证据共识"

3.1 DMSO 的代价有明确数据

10% DMSO + 90% 血清/培养基仍是行业默认配方，DMSO 已使用逾六十年。但其代价在多篇研究中被量化：

代价	量化数据	来源
膜流动性下降	5% DMSO使相对膜流动性降至0.88，10%降至0.91（对照1.00）	Joules等，2025
常温暴露损伤	10% DMSO于37℃暴露30min，多能细胞损失30%（对照仅5%）	katkov等，2011
T 细胞功能抑制	仅0.25%DMSO即损害CD4+ T 细胞活化； 1%完全消除其增殖	Yao&Matosevic,2021
骨髓细胞毒性	4℃下10%DMSO组室温放置15-60min，CFU-GM损失25%；30min可超75%	黄友章等 ，2006
复温后不洗脱的衰减	10%DMSO组室温放置15-60min，CFU-GM由68.5%降至30.4%	黄友章等 ，2006

最后一条对"冻存—运输—床边复温"的真实流程尤为关键：复温后若不立即洗脱 DMSO，细胞在 1 小时内可损失一半以上。

3.2 降到 5%：三条独立证据链一致支持

（1）外周血造血干细胞：5% DMSO + 6% HES 组 CFU-GM 回收率为 83.7 ± 10.8%，优于 10% DMSO 组的 78.9 ± 11.2%（黄友章等，2006）。

（2）调节性 T 细胞（nTreg）：在温度曲线完全不变（程序降温仪约 55 min 降至 −100 °C）的条件下，仅将 DMSO 由 10% 降至 5%，复苏 0 h 回收率由 58% 升至 73%，24 h 回收率由 20% 升至 45%（Kaiser 等，2021）。

（3）原代 NK 细胞：5% DMSO 配方冻存后活力 95.9 ± 0.5% → 92.2 ± 0.8%，仅下降 3.7 个百分点，可接受（Min 等，2018）。

值得注意的是 Kaiser 研究的设计细节：其自变量只有 DMSO 浓度，降温曲线全程不变——说明："降低 DMSO浓度的收益"并不必然要求改造降温工艺，两者可以解耦。这提示工艺开发者在做配方变更验证时，应先在固定曲线上确认收益，再评估是否需要联调曲线，避免把两个变量捆绑导致的归因混乱。

4. 非渗透性 CPA 的协同设计

基于第 2 节的胞外机制认识，非渗透性保护剂在配方中的角色是"胞外相行为设计者"：

类型	代表与典型浓度	作用
胞外撑体积、稀释电解质	HES 3-6%、HSA 4-10%、	扩大未冻液比例，缓解溶液效应
玻璃化载体/脱水剂	蔗糖0.1-0.5M、海藻糖约200mM	胞外脱水、辅助玻璃化，浓度过度致渗透休克
膜修复与抗剪切	Polomamer 188（P188） 1%	常见于无DMSO配方
冰重结晶抑制	抗冻肽、DNA折纸纳米材料	抑制复温段小冰晶长大

组合优于单用是反复出现的规律：5% DMSO + 6% HES 优于 10% DMSO 单用；蔗糖 + 甘油 + 异亮氨酸 + P188 的小分子组合可在无 DMSO 条件下达到与 10% DMSO 等效的回收率。反面案例同样有说服力：透明质酸/PEG 水凝胶包埋 MSC 在含 DMSO 时可维持活力与分化功能，去掉 DMSO 后活力仅剩约 0–5%——非渗透性载体无法替代渗透性 CPA 的脱水功能，除非同时引入极快的降温/复温。

5. 无 DMSO 路线：有希望，但应理性看待成熟度

目前并行存在四条无 DMSO 技术路径：

5.1小分子组合：250 mM 蔗糖 + 5% 甘油 + 5 mM 异亮氨酸 + 1% P188（Normosol-R 载体，可直接输注），NK-92 细胞回收率与 10% DMSO 等效（Joules 等，2025）；hiPSC 团块优化配方贴壁率达 104 ± 5.73%，优于 7.5% DMSO 的 58.4 ± 6.58%（Li 等，2020）。

5.2 聚合物/水凝胶包埋：海藻酸-壳聚糖微囊包埋胰岛存活 95.4% vs 未包埋 69.4%。

5.3生物模拟材料：抗冻肽-DNA 折纸纳米贴片使 HSC-3 细胞 1 个月存活 56%（10% DMSO 为 38%）。

5.4细胞状态预处理：冻存前用 NAC 或 IL-15 + IL-18 预处理，不改配方而改善复苏后存活（后者使 NK 细胞 24 h 回收率从 25% 升至 90–100%）。

但必须指出：目前尚无获批的无DMSO商业化T/NK细胞产品，该领域仍处于"婴儿期且极其困难"（Yao & Matosevic, 2021）。临床前iPSC研究中12/12全部使用 DMSO；CAR-T 产品普遍使用 5% 以上DMSO。理性的行业判断是：5% DMSO +非渗透性协同组分是未来数年的主流妥协点，无DMSO是前瞻研发布局。

6. 关键工艺原则：配方与降温速率必须联调

这是配方优化中最容易被忽视、也最能决定成败的原则。

6.1 热力学依据

Yao & Matosevic 明确指出："对于给定的CPA，更低的浓度需要更高的降温速率与更高的复温速率才能避免冰形成。"降低DMSO浓度会收窄可接受的降温速率窗口——保护剂少了，就必须靠更精准的速率控制来避免胞内冰。这就是配方升级会倒逼降温工艺升级的物理原因。

6.2 一个展示"窗口宽度由配方决定"的实验

Li 等（2020）在同一台程序降温仪上，比较两种配方在两个植冰（播种）温度下的表现：

配方	植冰-4℃	植冰-12℃
7.5%DMSO	贴壁率58.4±6.58%	贴壁率9.53-10.4%
优化无DMSO配方	贴壁率93.5±5.73%	与-4℃无显著差异

解读：DMSO 体系对植冰温度偏移 8 °C 极度敏感（效果掉至 1/6），而优化配方把这种敏感性抹平了。这说明——配方决定工艺窗口的宽度，速率与成核精度决定实际操作能否落在窗口内，两者缺一不可。

6.3 成核温度是最被低估的配方耦合变量

Massie 等（2014）在200 mL大体积样品上的经典对照显示：同一设备、同一配方、同一降温速率，仅植冰时机不同——成核发生于 <−12℃时回收率约 40%，>−8℃时回收率超过 90%。植冰温度本质上是"让脱水从什么超冷度开始"的配方相关参数：CPA 浓度、细胞浓度都会改变成核行为，因此植冰温度应作为配方验证的正式因子纳入实验设计，而非固定的设备参数。

6.4 复温必须与配方、降温曲线配对

Mazur 的配对规则：快冻的样品必须快融（否则小冰晶在复温段重结晶长大，造成二次杀伤）；慢冻的样品反而慢融更优（快融引发渗透性休克）。此外，复温段的相变潜热会直接"吃掉"设定的升温斜率——"由于−15至0℃区间吸收潜热，复温速率会被拉低"（Nat Biomed Eng 2021 综述）。对玻璃化路线，临界复温速率须超过临界降温速率至少一个数量级。任何配方变更若改变了样品的含冰量与玻璃化份额，复温工艺必须重新验证。

6.5 注意耦合并非绝对

Kaiser 等（2021）的 Treg 研究表明，降DMSO的收益可以在曲线完全不变的情况下兑现；Li 等（2020）的优化配方甚至放宽了工艺容差。因此正确的工程表述是："配方变更会改变工艺窗口的位置或宽度，须重新验证"，而非"任何配方变更都必须更换设备"。这是工艺转移与放大的核心判断。

7. 优化方法论：一个可操作的验证框架

综合上述证据，推荐按以下框架开展 CPA 工艺优化：

第一步：明确细胞特性参数。最优降温速率由膜水通透性（Lp）、细胞直径（比表面积）、胞内成核温度共同决定，跨细胞类型可相差三个数量级（人红细胞约 2,500 °C/min；T/NK 细胞约 1 °C/min；人卵母细胞 1 °C/min 以下无胞内冰、5 °C/min 以上全部胞内冰；胰岛 0.25–0.5 °C/min）。配方优化的起点是"按细胞类型求解"，不存在通用配方。

第二步：以DOE系统扫描配方空间。核心因子至少包括：渗透性CPA种类与浓度（如DMSO 5%vs10%）、非渗透性协同组分（HES/HSA/蔗糖）、植冰温度（−4至−12℃）、细胞浓度。响应指标应超越“复苏活力”，纳入功能性指标（CFU、贴壁率、杀伤活性、分化能力等）与复苏后时效衰减（0 h / 24 h）。

第三步：配方与曲线联合验证。在候选配方确定后，扫描降温速率与植冰温度矩阵，确认工艺窗口宽度；同步验证复温方式（水浴温度与时间的上/下限）。特别关注大体积场景——装量放大后热传递不均会同时破坏降温均匀性与成核一致性，配方在 1 mL 验证通过的窗口未必在 100 mL 成立。

第四步：建立复苏后时效标准。黄友章等的数据（10% DMSO组室温60 min后CFU-GM腰斩）提示，"洗脱时限"应作为工艺验证的一部分，尤其是涉及运输与床边复温的应用。

第五步：验证放大一致性。冻存容器几何、装量、位置都会改变实际穿越曲线；批量放行标准应包含温度曲线记录与成核一致性核查。

8. 结论

细胞冻存保护剂工艺的优化，本质是一个多变量协同设计问题：保护剂通过调节胞外相行为与胞内玻璃化状态同时对抗两类方向相反的冷冻损伤；其浓度决定工艺窗口的宽度，而降温速率、植冰温度与复温方式决定实际工艺能否落在窗口之内。当前证据支持的最优实践可概括为四句话：

（1）DMSO从10%降至5%，配合HES/HSA等非渗透性组分，是当前证据最充分、风险最低的优化方向；

（2）配方变更必然移动工艺窗口，降温与复温曲线必须随之重新验证，反之亦然；

（3）植冰温度是配方与工艺之间的枢纽变量，在大体积场景中其影响可达回收率一倍以上，应作为正式工艺参数管理；

（4）无 DMSO是方向而非现实，任何宣称"全面替代"的配方都应要求提供跨细胞类型、跨体积的系统性验证数据。

 

主要参考文献

1. Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol, 1984.

2. 黄友章, 等. 二甲基亚砜与羟乙基淀粉程控降温与低温冰箱降温保存造血干细胞的比较, 2006.

3. Kaiser AD, et al. Freezing medium containing 5% DMSO enhances the cell viability and recovery rate after cryopreservation of regulatory T cell products ex vivo and in vivo, 2021.

4. Joules S, et al. Systematic evaluation of cryopreservation parameters for NK-92 cells, 2025.

5. Li R, et al. DMSO-free programmed cryopreservation of fully dissociated and adherent human induced pluripotent stem cells, 2020.

6. Yao X, Matosevic S. Cryopreservation of NK and T cells without DMSO for adoptive cell therapy, 2021.

7. Massie I, et al. GMP cryopreservation of large volumes of cells for regenerative medicine: active control of the freezing process, 2014.

8. Min K, et al. Optimization of large-scale expansion and cryopreservation of human natural killer cells for anti-tumor therapy, 2018.