Pepstatin精准抑制天冬氨酸蛋白酶，助力揭示自噬与免疫调控新机理
Pepstatin (T3695)，CAS: 26305-03-3 是一种高度特异的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，最早用于抑制胃蛋白酶样酶活，随后被证实可在生化与细胞体系中抑制 HIV 蛋白酶活性[1]。其作用机制基于过渡态模拟：分子骨架中的（异）司他汀基序与活性位点的双天冬氨酸形成稳定的非产物复合物，从而阻断肽键水解。凭借对该保守催化基序的占据，Pepstatin 能在多种依赖天冬氨酸蛋白酶的生物过程中抑制蛋白水解。
在自噬通路中，Pepstatin 常用于抑制溶酶体天冬氨酸蛋白酶（如 Cathepsin D/E），因而选择性阻断自噬通量的末端降解步骤。自噬历经起始（ULK1 复合物）、成核（Beclin 1–VPS34）、膜延伸与封闭（ATG 级联与 LC3 脂化）、以及自噬体–溶酶体融合和内容物降解。Pepstatin 在溶酶体降解阶段的抑制使囊泡形成与底物清除分离，导致自噬体与底物（如 LC3‑II、p62/SQSTM1）积累，这一特性用于定量自噬通量与解析在营养与胁迫条件下的限速环节[2]。鉴于溶酶体降解参与氨基酸回收，Pepstatin 亦有助于研究自噬介导的氨基酸稳态与代谢耦联。
在 HIV 蛋白酶相关研究中，Pepstatin 抑制该病毒天冬氨酸蛋白酶介导的自切与后续成熟切割，因而可用于解析 Gag 与 Gag‑Pol 的加工、病毒颗粒形态建成以及活性位点结构–功能关系。相较广谱抑制剂，Pepstatin 通过与活性位点的互补配对，实现对天冬氨酸蛋白酶依赖性蛋白水解的选择性干预，可用于产毒细胞与无细胞体系的机制研究[1]。
Pepstatin 亦是研究蛋白质稳态网络的关键工具。尽管蛋白酶体为苏氨酸蛋白酶复合体而非天冬氨酸蛋白酶，Pepstatin 对溶酶体天冬氨酸蛋白水解的特异性抑制，为与蛋白酶体抑制剂的联用提供互补手段，从而解析自噬‑溶酶体系统与泛素‑蛋白酶体途径在蛋白质质量控制、细胞器更新与胁迫应答中的分工与串扰。凭借特异性与已报道的口服活性，Pepstatin 被用于从体外酶学到细胞与整体水平的研究，包括时序性的底物降解分析、自噬遗传‑药理互作图谱构建、以及新型天冬氨酸蛋白酶抑制剂的基准比较。结合定量读出（长寿命蛋白周转、LC3 加工与底物报告）与正交干预，Pepstatin 为自噬降解端与病毒及细胞生物学中的天冬氨酸蛋白水解提供了精确操控手段[2]。
■ 2. 文献分享
■ 2.1 Autonomous Hydrogel Actuators Programmed by Endogenous Biochemical Logic for Dual-Stage Morphing and Drug Release.
Pepstatin (T3695) 在本研究中被明确为一种选择性的胃蛋白酶抑制剂。研究表明，通过调节 Pepstatin 的浓度，可以精细地控制两项关键性能指标：药物释放速率以及形状恢复速率。作者指出，这两项速率均可随着 Pepstatin 浓度的改变而被精准调谐，说明 Pepstatin 在该体系中作为化学调控手段，能够有效调节与材料行为相关的动力学过程。依托其抑制作用，研究实现了对体系释放所载药物的速度以及结构在变形后恢复速度的精确控制。这些结果表明，Pepstatin 的用量与体系在时间尺度上的响应密切相关，可作为调节释放与恢复动力学的关键因素。[3]
■ 2.2 Cathepsin-D-mediated MHC class I degradation contributes to immune evasion in colorectal cancer.
▲ 通过Western blot和流式细胞术检测Pepstatin处理后MHC-I类分子表达、共聚焦显微镜观察HLA-ABC亚细胞分布、细胞膜和溶酶体组分分析MHC-I类分子转运，结合AOM/DSS诱导的自发性结肠癌模型及CT26皮下/盲肠浆膜下荷瘤模型中的肿瘤数量、生长曲线、生存曲线、CD8⁺T细胞浸润及GZMB⁺/IFN-γ⁺CD8⁺T细胞比例检测，综合证实Pepstatin可通过抑制CTSD阻断MHC-I类分子的溶酶体降解，增强抗原呈递并逆转免疫逃逸，从而增敏抗PD-1抗体的抗肿瘤疗效。
Pepstatin (T3695) 被描述为能够有效抑制CTSD活性的天冬氨酸蛋白酶抑制剂。在结直肠癌细胞中，Pepstatin 以剂量依赖方式上调HLA-ABC与细胞表面MHC I，并促进MHC I向质膜定位、减少其在溶酶体中的存在；细胞分馏进一步显示膜组分中的HLA-ABC蛋白升高而溶酶体组分下降。与此一致，使用 Pepstatin 可增强MHC I表达并增加CD8+效应T细胞的浸润。在多种小鼠结直肠癌模型中，Pepstatin 提升了抗PD-1抗体的效力：在AOM/DSS诱导的原位模型中，Pepstatin 联合抗PD-1使结直肠肿瘤的大小与数量显著下降；在盲肠CT26移植模型中，联合用药表现为肿瘤生长最慢、体积最小；在CT26与MC38皮下异种移植模型中，Pepstatin 联合抗PD-1显著降低肿瘤负荷并延长总体生存。上述效应伴随CD8+ T细胞浸润增加；流式检测亦显示，在使用 Pepstatin 和/或抗PD-1的组别中，IFN-γ+与GZMB+ CD8 T细胞数量上升。综合结果表明，Pepstatin 通过促进MHC I表达以抑制免疫逃逸，并提升对抗PD-1抗体的敏感性。[4]
■ 2.3 Aspartic Proteases Drive Stress Response, Morphogenesis, and Macrophage Interaction in Sporothrix brasiliensis.
Pepstatin (T3695) 在文献中被描述为可作用于真菌天冬氨酸蛋白酶并干预二型性转变的化合物。针对 Paracoccidioides brasiliensis，文中指出 Pepstatin 可以抑制由菌丝型向酵母型的二型性转换。在 Sporothrix brasiliensis 中，文中进一步报告，Pepstatin 通过抑制天冬氨酸蛋白酶而阻断了由菌丝型向酵母型的二型性转化。以上被引述的结果共同表明，Pepstatin 作为天冬氨酸蛋白酶抑制剂，能够在不同的二型性致病真菌中抑制或阻断由菌丝型向酵母型的转变。证据明确展示了 Pepstatin 在 Paracoccidioides brasiliensis 中对菌丝到酵母的转换具有抑制作用，并且在 Sporothrix brasiliensis 中通过抑制天冬氨酸蛋白酶而阻断该转化过程。[5]
■ 2.4 Prorenin in Hepatic Stellate Cell Extracellular Vesicles Induces Platelet-Dependent Thrombin Formation and Release of Profibrotic TGF-β.
▲ 胃蛋白酶抑制剂呈浓度依赖性抑制肝星状细胞胞外囊泡诱导的血小板聚集，表明其通过抑制天冬氨酸蛋白酶活性阻断该激活通路。
Pepstatin (T3695) 在本研究中被明确描述为“类别特异性抑制剂”，并在作者设定的实验体系中展现出对关键细胞反应的显著抑制作用。依据作者的表述，Pepstatin 阻断了由肝星状细胞（HSC）来源的细胞外囊泡所诱导的血小板活化。研究直接指出，Pepstatin 以类别特异性抑制剂的身份出现，并在以这些囊泡作为刺激源的条件下，能够阻止血小板发生活化。这一结果表明，在实验所采用的检测条件中，Pepstatin 能够有效中止血小板对来自 HSC 的囊泡刺激所产生的活化反应。通过将 Pepstatin 明确界定为类别特异性抑制剂，并记录其阻断该反应的能力，作者呈现了清晰的实验结论：当 HSC 衍生的细胞外囊泡用于刺激血小板时，加入 Pepstatin 能够使该活化终点不再出现。上述表述界定了 Pepstatin 在本研究中的作用，即在所测试的情境下实现对血小板活化的抑制，并以其“类别特异性抑制剂”的属性与所观察到的阻断效果相吻合，构成了研究中关于 Pepstatin 的核心正向发现。[6]
■ 3. 结语
Pepstatin 通过模拟过渡态，特异性结合并稳定天冬氨酸蛋白酶活性位点的双天冬氨酸，阻断肽键水解实现抑制作用。文献显示其在抑制溶酶体 Cathepsin D/E 活性以解析自噬通量、干预 HIV 蛋白酶成熟过程、促进结直肠癌中 MHC I 表达与 CD8+ T 细胞浸润以抑制免疫逃逸方面具有重要功能。此外，Pepstatin 可阻断致病真菌的二型性转变及肝星状细胞来源囊泡诱导的血小板活化。未来研究可聚焦其在免疫检查点调节、抗真菌治疗及纤维化相关血小板活化抑制中的潜在应用，同时作为精准的生化工具，深入解析蛋白质稳态和自噬机制。
■ 4. Q&A
Q1: Pepstatin 是通过何种机制抑制天冬氨酸蛋白酶的？
A1: Pepstatin 通过模拟过渡态，结合活性位点的双天冬氨酸，稳定非产物复合物，阻断肽键水解，从而实现抑制作用。
Q2: Pepstatin 如何影响结直肠癌中的免疫反应？
A2: Pepstatin 抑制 Cathepsin D 活性，剂量依赖性上调并促进 MHC I 在质膜的定位，增强 CD8+ T 细胞浸润，提升抗 PD-1 抗体的治疗效果。
Q3: 除自噬外，Pepstatin 在哪些生物过程中显示了抑制活性？
A3: Pepstatin 抑制 HIV 蛋白酶成熟切割，阻断致病真菌的二型性转变，并抑制肝星状细胞来源囊泡诱导的血小板活化。
■ 5. 参考文献
[1] Umezawa H, Aoyagi T, Morishima H, Matsuzaki M, Hamada M, Takeuchi T. Pepstatin, a new pepsin inhibitor produced by Actinomycetes. J Antibiot (Tokyo). 1970;23(5):259-262.
[2] Mizushima N, Yoshimori T, Levine B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 2010;140(3):313-326.
[3] Liu Y, Potthuri H, Sosnik A, Khoury L. Autonomous Hydrogel Actuators Programmed by Endogenous Biochemical Logic for Dual-Stage Morphing and Drug Release.. Advanced materials (Deerfield Beach, Fla.). 2026;38(12):e16809.
[4] Zhan W, Fu Y, Liu Y, Cai R, Bai F, Guo C, et al.. Cathepsin-D-mediated MHC class I degradation contributes to immune evasion in colorectal cancer.. Cell reports. Medicine. 2026;7(1):102534.
[5] de Moraes L, Segura W, Oliveira R, Lima S, Fuzeti D, Ferreira K, et al.. Aspartic Proteases Drive Stress Response, Morphogenesis, and Macrophage Interaction in Sporothrix brasiliensis.. Mycopathologia. 2025;191(1):7.
[6] Chen R, Huang E, Wu X, McMullen M, Wang X, Nagy L, et al.. Prorenin in Hepatic Stellate Cell Extracellular Vesicles Induces Platelet-Dependent Thrombin Formation and Release of Profibrotic TGF-β.. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 2025;39(20):e71125.
