Rag2-KO/hCRBN：CRBN基因人源化免疫缺陷小鼠的构建与验证

靶向蛋白降解类候选分子走到体内评价这一步，常常需要一只CRBN 基因人源化小鼠作为前提。这类分子不直接抑制靶蛋白的活性，而是把靶蛋白拉到 E3 泛素连接酶附近，借细胞自身的泛素-蛋白酶体系统把它降解掉。在已被开发利用的 E3 连接酶中，CRBN（cereblon）是研究积累较多的一个：它是 CRL4 泛素连接酶复合物的底物受体亚基，沙利度胺类药物与多个分子胶化合物都依赖它发挥作用——化合物结合在 CRBN 表面，改变其底物识别偏好，使原本不被识别的蛋白被招募并降解。

问题在于物种差异。人与小鼠的CRBN 在与这类化合物结合的关键区域上存在序列差异，这使得在普通小鼠体内，针对人 CRBN 设计的化合物往往难以重现其在人源细胞中的降解活性。换言之，候选分子在体外人源体系里表现良好，搬到野生型小鼠身上做药效和毒性评价时，读出的结果未必反映它在人体内的行为。要在体内评价这类化合物，承载人源 CRBN 的小鼠是一个前提条件。

另一重需求来自受试体系本身。分子胶与降解剂类候选药物的体内评价，常需要在小鼠体内植入人源肿瘤细胞或人源免疫细胞；而成熟淋巴细胞的存在会带来排斥，使植入难以建立。Rag2 编码重组激活基因 2 蛋白，参与 V(D)J 重组这一 T、B 淋巴细胞抗原受体基因重排的必需步骤，该基因失活后 T、B 细胞发育在早期阶段受阻。把 CRBN 人源化与 Rag2 失活叠加在同一品系上，意味着同一只小鼠既能响应靶向人 CRBN 的化合物，又具备接受人源细胞植入的免疫背景。

这款由南模生物研发的在免疫缺陷小鼠Rag2-KO基础上进行CRBN人源化的人源化品系（目录号 NM-XA-251818）即建立在这一思路上。该品系由 hCRBN 小鼠（NM-HU-225071）与 Rag2-KO 小鼠（NM-KO-190429）交配获得，两项修饰在同一遗传背景下合并。

Fig.1 Detection of CRBN expression in small intestine, brain, muscle, thymus, liver and spleen by RT-PCR.
 

Fig.2 Detection of Rag2 expression in small intestine, brain, muscle, thymus, liver and spleen by RT-PCR.
 

Fig.3 Detection of CRBN expression in Rag2-KO/hCRBN mice by WB.
 

Fig.4 T and B cell frequencies in the spleen and peripheral blood of WT C57BL/6 mice, HO Rag2-KO and HO/HO Rag2-KO/hCRBN mice. 
 

Fig.5 The degradation of GSPT1, IKZF3 and CK1a by CC-885 in Rag2-KO/hCRBN and Rag2-KO mice in vivo.
 

Fig.6 In vivo hepatotoxicity evaluation of CC-885 in Rag2-KO and Rag2-KO/hCRBN mice. 

人源CRBN 转录本的组织表达（图1）。 取小肠、脑、肌肉、胸腺、肝脏和脾脏，反转录后以 mRNA 引物进行 RT-PCR 检测 CRBN 表达。结果显示，小鼠 Crbn mRNA（185 bp）在 Rag2-KO 纯合子与野生型 C57BL/6 小鼠中均可检出；人源 CRBN mRNA（374 bp）仅在 Rag2-KO/hCRBN 纯合子中检出，在 Rag2-KO 纯合子和野生型小鼠中未检出。

Rag2 转录本的缺失（图2）。 同批组织以相同方法检测 Rag2 表达。小鼠 Rag2 mRNA（163 bp）仅在野生型 C57BL/6 小鼠中检出，在 Rag2-KO 纯合子与 Rag2-KO/hCRBN 纯合子中均未检出。两张图合起来，从转录水平同时确认了人源序列的引入与 Rag2 的失活。

CRBN 蛋白水平的检测（图3）。 取 7 周龄雄性野生型 C57BL/6 小鼠与 7 周龄雄性 Rag2-KO/hCRBN 纯合子的脾脏、肝脏、脑、骨骼肌和小肠组织裂解液，用抗 CRBN 抗体进行 Western blot。两种基因型的上述组织中均可检出 CRBN。产品页注明，所用抗体对人源与小鼠 CRBN 存在交叉反应，因此该结果反映的是 CRBN 蛋白在组织中的存在，而非人源与鼠源的区分——区分由图1 的转录本检测承担。

T、B 细胞比例（图4）。 采集 8 周龄雄性野生型 C57BL/6 小鼠，以及 10 周龄雄性 Rag2-KO/hCRBN 纯合子和 Rag2-KO 纯合子的脾脏与外周血，比较其中 T 细胞与 B 细胞比例。产品页图注给出的结论为：Rag2-KO/hCRBN 小鼠的脾脏和外周血中存在 T 细胞和 B 细胞缺陷。

化合物处理后底物蛋白的检测（图5）。 取 8 周龄雌性 Rag2-KO/hCRBN 纯合子与 6 周龄雌性 Rag2-KO 纯合子，在给予溶媒或 CC-885（5 mg/kg）6 小时后采集骨骼肌、心脏和脾脏，用抗 GSPT1、抗 IKZF3、抗 CK1α 抗体进行 Western blot，检测这三个底物蛋白在两种基因型中的降解情况。

给药后的肝脏指标评估（图6）。 同样在溶媒或 CC-885（5 mg/kg）处理 6 小时后，对 8 周龄雌性 Rag2-KO/hCRBN 纯合子与 6 周龄雌性 Rag2-KO 纯合子进行血清生化分析，用于评估 CC-885 的体内肝毒性。

图5 与图6 的具体结果以产品页所示图片为准，建议阅读时对照原图。

从上述验证数据可以看到这款模型提供了什么：一个体内同时具备人源CRBN 表达与 T、B 细胞缺陷的背景，并已配合 CC-885 这一 CRBN 分子胶工具化合物建立了底物蛋白与血清生化两套读出。对于依赖人 CRBN 的分子胶、降解剂类候选分子，这样的背景可用于在体内层面观察底物蛋白水平的变化，并在同一体系中同步收集安全性相关指标；T、B 细胞的缺陷则为需要植入人源细胞的实验设计留出了空间。需要说明的是，具体实验能否获得预期结果，取决于化合物性质与实验设计，建议结合自身体系预实验确定方案。

人与小鼠的CRBN 在与化合物结合的关键区域存在序列差异，针对人源序列设计的分子胶在普通小鼠体内往往难以重现降解活性。Rag2-KO/hCRBN 小鼠（NM-XA-251818）在 Rag2 基因敲除所致 T、B 细胞缺陷背景上叠加人源 CRBN；官网已验证该人源转录本仅在纯合子中检出，脾脏与外周血存在 T、B 细胞缺陷，并以 CC-885 建立了底物蛋白与血清生化两套检测读出。

该品系由南模生物研发，目录号NM-XA-251818。更多品系信息与验证数据详见南模生物官网产品页，亦可通过官网咨询通道了解详情。

上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于 2000 年 9 月，是上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），专注于模式生物领域，为高校、科研院所及制药企业提供基因修饰动物模型产品与解决方案。咨询电话 400-728-0660。

阅读原文