小型自动移液分装仪在畜禽肉林可霉素检测中的应用

方案摘要：本方案针对畜禽肉中林可霉素等 9 种大环内酯类抗生素残留检测（LC-MS/MS 法），引入FDT-DP-01 小型自动移液分装仪，替代人工移液操作，用于标准系列溶液、内标溶液、试剂的精准分装与加样。样品经乙腈提取、正己烷脱脂、HLB 固相萃取净化，浓缩定容后采用液相色谱 - 串联质谱检测，内标法定量。利用自动移液分装仪提升移液重复性、降低人为误差，提高兽药残留批量检测的稳定性与工作效率，适用于畜禽肉中大环内酯类药物残留日常筛查与定量检测。
 
方案详情：
1、实验原理
畜禽肉中九种大环内酯类抗生素(林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉它霉素和交沙霉素)的残留用乙腈提取，提取液用正己烷去除脂肪后浓缩，再用磷酸盐溶液溶解后，经OasisHLB固相萃取柱净化，甲醇洗脱，洗脱液浓缩定容后，供液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。本方法中标准工作液配制、内标添加、试剂等分液步骤由 FDT-DP-01 小型自动移液分装仪完成，保证移液体积精准一致，减少人工操作带来的系统偏差。
2、实验准备
2.1设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
2.1.1 液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源；
2.1.2 天平:感量0.01g,0.0001g；
2.1.3 固相萃取装置；
2.1.4 氮气浓缩仪；
2.1.5 具塞聚丙烯离心管:50mL；
2.1.6 离心机；
2.1.7 小型自动移液分装仪 FDT-DP-01：用于标准溶液梯度配制、内标工作液、试剂自动移液分装，可兼容各种量程的Pipetty电动移液器、Fluidot蠕动泵分液器、注射泵分液器，实现从微升、毫升、升级别的分液。
 
2.2主要试剂
  除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水
2.2.1 甲醇:色谱纯；
2.2.2 乙腈:色谱纯；
2.2.3 正已烷;色谱纯；
2.2.4 甲酸铵；
2.2.5 磷酸氢二钠；
2.2.6 氢氧化钠；
2.2.7 氯化钠；
2.2.8 2%氯化钠溶液；
2.2.9 磷酸盐缓冲溶液；
2.2.10 甲醇＋水溶液(2+3)；
2.2.11甲酸铵溶液:0.1 mmol/L；
2.2.12 林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉它霉素、交沙霉素和罗红霉素(roxithromycin)标准物质:纯度≥95%。
2.2.13 标准储备溶液；
2.2.14 混合标准储备溶液；
2.2.15 混合标准工作溶液；
2.2.16 内标储备溶液；
2.2.17 中间浓度内标溶液；
2.2.18 内标工作溶液；
2.2.19 基质标准工作溶液；
2.2.20 Oasis HLB固相萃取柱；
2.2.21 滤膜:0.2 pm。
 
3、试样制备与保存
3.1 制备
试样的制备从全部样品中取出有代表性样品约1kg，充分搅碎，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封后作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
3.2 保存
将试样于-18°C保存。
4、测定步骤
4.1 提取
称取5 g试样，精确至 0.01 g，置于50 mL离心管中，采用FDT-DP-01小型自动移液分装仪加入10.0 μL内标工作溶液和15.0 mL 乙腈，于振荡器上剧烈振荡 10 min。以 4200 r/min 的转速离心 5 min，取上清液于另一离心管中，加入2.0 g氯化钠和 10.0 mL 正己烷，于振荡器上剧烈振荡 10 min。以 4200 r/min 的转速离心 10 min，小心吸取中间乙腈层 12.0 mL 于另一离心管中，用氮气浓缩仪于 55 ℃水浴中吹至近干。
 
4.2 净化
用 7 mL 磷酸盐缓冲溶液分两次溶解残液，使样液以小于 1.0 mL/min 的流速通过 Oasis HLB 固相萃取柱。样液全部流出后，再用 10 mL 水和 5 mL 甲醇 + 水溶液洗柱，弃去全部流出液，固相萃取柱用真空泵抽干 1 h。再用 10 mL 甲醇洗脱于 15 mL 锥形试管中，用氮气浓缩仪于 55 ℃水浴中吹至近干，使用FDT-DP-01准确加入 1.0 mL 甲酸铵溶液溶解残渣。用阴性样品，按上述步骤制备空白样品提取液。过 0.2 μm 滤膜后，供液相色谱 - 串联质谱仪测定。
4.3 测定
4.3.1 液相色谱条件

• 色谱柱:Intersil Cis,3 pm,150 mmX2.1 mm 或相当者;
• 进样量:20 L;流速:0.5 mL/min;
• 柱温:20°C;
• 流动相:A:0.1mmol/L甲酸铵溶液，B:乙腈。梯度洗脱条件见表1。

4.3.2 质谱条件

• 离子源:电喷雾离子源;
• 扫描方式:正离子扫描;
• 检测方式:多反应监测;
• 电喷雾电压:5 500 V;
• 雾化气压力:0.069 MPa;
• 气帘气压力:0.69MPa;
• 辅助气流速:0.414 MPa;
• 离子源温度:350°C;
• 碰撞室出口电压:2.0V;
• 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压，见表2。

 
4.3.3 液相色谱-串联质谱测定
4.3.3.1 定性测定
在相同试验条件下,待测样品溶液中被测物的保留时间与基质标准工作溶液中被测物的保留时间的比值，偏差在±2.5%之内。并且，待测样品溶液中，被测物中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准工作溶液中被测物的各定性离子相对丰度的比值，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
 
 
4.3.3.2 定量测定
在仪器最佳工作条件下，以基质标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。基质标准工作溶液由 FDT-DP-01 自动移液分装仪配制，保证梯度浓度准确。用基质标准工作溶液的工作曲线对样品进行定量，应使样品溶液中九种大环内酯类抗生素的响应值在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，九种大环内酯类抗生素的参考保留时间见表 4。
 
 
4.4 平行试验
按试样步骤，对同一试样进行平行试验测定。批量平行样的内标添加、试剂加样可由 FDT-DP-01 自动完成，降低平行样 RSD。
4.5 空白试验
不称取样品，其余均按试样步骤进行。空白溶液配制同样使用 FDT-DP-01 移液分装仪，保证空白体系与样品体系一致。
5、 结果计算
试样中林可霉素等大环内酯类抗生素残留量按下式计算：
 
6、FDT-DP-01 小型自动移液分装仪应用优势
6.1 提升移液精度与重复性：替代人工手动移液，微量内标（μL级）和常量试剂自动分配，降低人为读数、手压误差，改善标准曲线线性、平行样相对标准偏差；
6.2 提高批量前处理效率：畜禽肉兽药残留检测常批量送检，设备可编程批量分装试剂与内标，减少前处理人力耗时；
6.3 降低交叉污染风险：可匹配一次性吸头，程序控制吸液 / 排液，减少试剂反复转移带来的污染，适合痕量兽药残留检测；
6.4 方法稳定性强：基质标准系列、空白、质控样统一移液条件，减少批次间差异，方便实验室内部质量控制；
6.5 操作友好：预设移液程序可保存，检测人员一键调用，降低人员操作水平对检测结果的影响，便于标准化 SOP 落地。