STZ/HFD小鼠与MIN6细胞糖尿病模型实操参考及验证要点
糖尿病研究离不开可靠模型。动物模型模拟整体病理，细胞模型解析分子机制。本文梳理常用糖尿病小鼠模型构建、GTT/ITT/GSIS 评估、MIN6 高糖损伤模型及验证要点，附操作参考与 Q&A。
Section.01
先分清: 糖尿病不止一种
根据病因和临床特征，糖尿病通常分为 1 型糖尿病、2 型糖尿病和妊娠期糖尿病。首先，我们通过一张表来了解 1 型/2 型糖尿病。
图 1. 糖尿病类型[1]。
Section.02
糖尿病研究 (上篇):
动物模型的构建与验证
糖尿病研究模型主要分为动物模型 (体内) 和细胞模型 (体外) 。其中，动物模型是最常用的研究工具，能模拟疾病的整体病理生理过程。
科研中常用的糖尿病小鼠模型一般分为自发性：自然发生；诱导性：用化学、药物或物理方法诱导；遗传改变：比如转基因模型等。常用糖尿病动物模型概述见图 2-1，用于研究糖尿病及其并发症的各种实验模型见图 2-2[2]。
其中，化学诱导模型中，链脲佐菌素 (STZ) 是造模常用物质之一。STZ 通过特异性破坏胰岛 β 细胞，模拟 1 型糖尿病[2]。
『T1D 小鼠模型： STZ 诱导的高血糖症』
经典方案采用腹腔注射单次高剂量 STZ，150 mg/kg，诱导 12 周龄雄性小鼠发生 β 细胞耗竭和高血糖。
每周监测小鼠的总体重和血糖水平。非空腹血糖>250 mg/dL 的小鼠被判定为高血糖。进行葡萄糖耐量试验 (GTT) 以确诊高血糖。
操作步骤 (供参考[3])
时间：4 周
1. 将 STZ 溶解于新鲜配制的 pH 4.5 柠檬酸钠缓冲液中，浓度为 10 mg/mL。
2. 将 12 周龄的 C57BL/6J 雄性小鼠分成两组 (n = 12) ，在注射 STZ 前禁食 4-6 小时。
3. 腹腔注射 150 mg/kg STZ 或赋形剂。
4. 连续 4 周，每周监测小鼠的体重、血糖和胰岛素水平。
5. STZ 治疗 4 周后进行葡萄糖耐量试验。
避坑提示：STZ 注射后 1–2 小时可能出现低血糖反应，需密切观察。注射 6 小时后可提供 5%–10% 葡萄糖水，24 小时后恢复正常饮水。单次高浓度 STZ 可能诱发高血糖导致死亡，建议先用较低剂量预实验。
『T2D 小鼠模型：HFD 诱导的胰岛素抵抗』
为了诱导胰岛素抵抗，将 6 周龄雄性小鼠喂食 60% 高脂饮食 10 周。
每周监测小鼠的总体重。喂食 HFD 10 周后，进行葡萄糖耐量试验 (GTT) 和胰岛素耐量试验 (ITT) 以确认饮食诱导的胰岛素抵抗。
操作步骤 (供参考[3])
时间：10 周
1. 将 5 周龄的 C57BL/6J 雄性小鼠分成两组 (每组 n = 12) ，分别饲养在笼子里 (每笼 4 只小鼠) ，饲养 1 周。
2. 将一组六周龄小鼠喂以高脂饮食 (HFD) (60 kcal% 脂肪)，另一组小鼠喂以普通饲料 (CD) ，持续 10 周。
3. 每周监测每只小鼠的体重。
4. 高脂饮食喂养 10 周后进行葡萄糖耐量试验。
5. 将小鼠放回原笼中再饲养 2 天，以确保血糖恢复到基础水平。
6. 恢复期 2 天后进行胰岛素耐量试验。
多维度评估：你的动物造模成功了吗？
判断糖尿病动物模型是否造模成功，主要依据血糖水平：
- 空腹血糖 ≥16.67 mmol/L 或血糖连续 3 天超过 250 mg/dL；
还可结合典型症状：
(1) 体重下降 (一少); 出现多饮、多食、多尿现象 (三多)[4]；
(2) 血浆胰岛素、C-肽浓度显著降低[5];
(3) 血浆胆固醇显著升高、低密度脂 (LDL) 水平显著升高等[6]；
(4) 葡萄糖耐量试验 (GTT) 和胰岛素耐量试验 (ITT) 等进行综合评估。
『葡萄糖耐量试验 (GTT) 』
——测"降糖能力"。
- 核心目的：就好比给小鼠灌一针管的葡萄糖，看看它需要花多久能把血糖降回正常水平。这反映的是胰岛素的总体分泌效果和身体利用糖的能力 (如果血糖居高不下，说明胰岛素分泌不足或作用不够)。
- 结果解读：正常情况下，血糖会在 30 分钟左右达到峰值，然后迅速下降。如果 120 分钟时血糖依然很高，说明小鼠存在糖耐量异常 (IGT)，即糖尿病前期或糖尿病状态。
——T1D：曲线下面积显著增大，提示胰岛素绝对缺乏，无法清除血糖。
——T2D：早期可能正常或轻度受损 (高胰岛素代偿)，后期显著受损 (代偿衰竭)。
操作步骤 (供参考[3])
时长：8 小时
1. 准备：
(1) 小鼠禁食 6 小时，可自由饮用经高压灭菌的水。
(2) 配制浓度为 0.05 g/mL 的葡萄糖生理盐水溶液。
(3) 用耳标或记号笔给小鼠做标记。
(4) 依次称量小鼠体重，测量空腹血糖水平。
2. 注射：
(1) 根据每只小鼠的体重，计算其所需的 D-葡萄糖体积 (1g/kg 体重) 。
(2) 向小鼠腹腔注射 D-葡萄糖，并按顺序计时。
3. 采血检测：注射后 15、30、45、60、90 和 120 分钟测量血糖水平。
『胰岛素耐量试验 (ITT) 』
——测“胰岛素降糖效率” (即胰岛素抵抗)
- 核心目的：直接给小鼠注射外源性胰岛素，看看血糖下降的幅度和恢复速度。这专门用来判断身体 (肝脏、肌肉、脂肪) 对胰岛素的敏感度——如果打了胰岛素血糖却降得很慢，说明存在胰岛素抵抗 (这是 2 型糖尿病的核心病因)。
- 结果解读：健康小鼠血糖会快速大幅下降；若下降幅度很小或下降后很快反弹，说明小鼠对胰岛素不敏感 (胰岛素抵抗)。
——T1D：因自身不分泌胰岛素，外源胰岛素注射后血糖下降通常很敏感 (除非严重脂毒性导致抵抗)。
——T2D：核心诊断指标。高脂喂养小鼠表现为明显的胰岛素抵抗 (血糖下降缓慢)。
操作步骤 (供参考[3])
时长：8 小时
1. 准备：
(1) 小鼠禁食 6 小时，可自由饮用经高压灭菌的水。
(2) 将胰岛素溶液用生理盐水稀释 100 倍至终浓度 0.8 U/mL。
(3) 用耳标或记号笔给小鼠做标记。
(4) 依次称量小鼠体重，测量空腹血糖水平。
2. 注射：
(1) 根据每只小鼠的体重，计算其所需的胰岛素用量 (1.5 U/kg 体重) 。
(2) 给小鼠腹腔注射胰岛素，并按顺序计时。
3. 采血检测：注射后 15、30、45、60、90 和 120 分钟测量血糖水平。 建议：先使用更低剂量 (0.5–1 U/kg) 做预实验，确认小鼠对胰岛素是否敏感，防止低血糖休克/死亡。
『葡萄糖刺激胰岛素分泌 (GSIS) 测定
一种在小鼠身上测试胰岛 β 细胞功能/胰岛素分泌能力的经典实验，通常用于糖尿病或肥胖研究。GTT 和 ITT 反映的是整体血糖调控，但 β 细胞本身分泌胰岛素的能力需要 GSIS 来直接评估。
- STZ 和 HFD 诱导的小鼠模型，其 GSIS 检测则主要是在活体小鼠上进行的体内 (in vivo) 实验，部分研究也会分离小鼠的胰岛进行离体 (ex vivo) 检测。
- 结果解读：正常健康小鼠注射葡萄糖后血浆胰岛素急剧升高后回落，糖尿病或胰岛受损小鼠该高峰消失或低平，提示胰岛β细胞无法对高糖快速反应，这是 2 型糖尿病早期灵敏指标。
操作步骤 (供参考[3])
时间：24 小时
1. 准备：
(1) 小鼠禁食 6 小时，可自由饮用经高压灭菌的水。
(2) 配制 0.15 g/mL (即 15%) 的葡萄糖溶液 (溶于生理盐水) ，以快速提高血浆胰岛素水平。
(3) 用耳标或记号笔给小鼠做标记。
2. 注射：
(1) 根据小鼠的体重，计算每只小鼠所需的 D-葡萄糖体积 (3 g/kg 体重) 。
(2) 向小鼠腹腔注射 D-葡萄糖，并按顺序计时。
3. 采血检测：
(1) 注射葡萄糖后，分别于 0、2、5 和 15 分钟 (第一阶段胰岛素分泌) 测量血糖水平，并从尾尖采血采集血样。
(2) 离心 (5000 ×g，15 分钟，4℃) ，收集血浆，并储存在 −80°C 以备后用。
(3) 用胰岛素超敏试剂盒测定血浆胰岛素水平。
Section.03
糖尿病研究 (下篇):
细胞模型的构建与验证
细胞模型可帮助研究者在体外环境中探究特定细胞类型的分子作用机制。高糖诱导的 MIN6 细胞损伤是体外研究糖尿病病理机制及胰岛 β 细胞功能的“经典实验”。它能够精准模拟高血糖环境对 β 细胞的直接影响，为我们解析胰岛素分泌异常及 β 细胞凋亡等事件提供了一个高度可控的细胞学平台。
Tips：
MIN6 细胞系源自小鼠胰岛瘤，高度保留了正常胰岛 β 细胞的生物学特性，尤其具备良好的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能 (GSIS)，其应答特征与真实 β 细胞高度接近，因此被广泛应用于 II 型糖尿病、胰岛素分泌机制及 β 细胞功能的相关研究。
『MIN6 细胞损伤模型操作步骤 (供参考) 』
常规培养条件下，MIN6 细胞置于 37 °C、5% CO2 恒温培养箱中，采用含 25 mM 葡萄糖、10%–15% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素 的 DMEM 培养基进行培养，待细胞融合度达到 70%–80% 时即可收集用于后续实验。
图 3. 高糖诱导的 MIN6 细胞损伤实验流程。
如图 3 所示，将 MIN6 细胞置于含高浓度葡萄糖 (通常为 25 mM) 的 DMEM 培养基中孵育 24–72 小时，以诱导胰岛 β 细胞损伤。
为更贴近 II 型糖尿病患者体内“糖脂毒性”的真实病理状态，还可在高糖基础上与棕榈酸 (0.2–0.5 mM) 联合处理 MIN6 细胞，以构建高糖 + 高脂联合损伤模型，效果更显著、更稳定。实验同步设立含低浓度葡萄糖 (通常为 5.5 mM) 的培养基组作为正常对照。
不过要注意，MIN6 细胞长期传代容易发生表型漂移，表现为胰岛素分泌能力下降、对葡萄糖敏感性降低，因此建议优先使用低代次细胞进行实验。
多维度评估：你的细胞模型成功了吗？
验证糖尿病体外细胞模型是否成功，核心在于确认模型是否复现了目标细胞在糖尿病状态下的核心功能缺陷和典型病理特征。
GSIS 检测是 MIN6 损伤模型有效性验证的核心评价指标。高糖单独干预或联合棕榈酸共刺激均可破坏 MIN6 细胞的胰岛素分泌功能，因此可通过胰岛素分泌水平反映 MIN6 细胞的损伤程度。
『体外细胞模型的GSIS 检测』
操作步骤 (供参考[7])
1. MIN6 细胞经不同浓度葡萄糖干预 24-72 小时后，弃去原培养基，并使用 PBS 充分洗涤去除残留培养液，随后置于含低浓度葡萄糖的 KRBH 缓冲液中静息培养 1 小时。
2. 恢复结束后，将 MIN6 细胞分别转移至含低浓度葡萄糖或高浓度葡萄糖的 KRBH 缓冲液中继续孵育 1 小时。
3. 孵育完成后，收集 MIN6 细胞上清液，采用 ELISA 试剂盒定量检测各组细胞的 GSIS 水平，相应流程见图 4[7]。
由图 5A–C 检测结果可见，高糖 (单独或联合棕榈酸) 刺激可显著抑制 MIN6 细胞的 GSIS。为排除渗透压干扰因素，可额外在低糖培养基中添加等渗甘露醇进行对照处理，结果显示甘露醇干预并未造成 GSIS 水平下降 (图 5D)，由此证实高糖诱导 MIN6 细胞胰岛素分泌功能受损并非由渗透压改变介导，而是高糖环境下的代谢应激所致。
图 5. 持续高血糖降低 MIN6 细胞胰岛素分泌[7]。
『其他验证指标：活力与凋亡』
采用上述方案构建 MIN6 细胞损伤模型后，除了胰岛素分泌功能的验证，还需开展系列验证实验以确认模型构建有效性，验证指标涵盖细胞活力及细胞凋亡水平等。
高糖诱导的 MIN6 细胞损伤可直观反映于细胞的活力变化。单一高糖干预或高糖联合棕榈酸共处理均可抑制 MIN6 细胞活力，该指标可通过 CCK-8 法或 MTT 法进行定量检测。
如图 6A 所示，CCK-8 检测结果证实，高糖与棕榈酸联合干预可呈时间、剂量依赖性下调 MIN6 细胞活力。
图 6. 高浓度葡萄糖可时间剂量依赖性抑制 MIN6 细胞活力[8]。
此外，细胞凋亡水平也可作为高糖诱导 MIN6 细胞损伤的关键佐证。长期暴露于高糖微环境时，MIN6 细胞会启动内源性凋亡通路，因此凋亡相关蛋白的表达及凋亡阳性细胞的占比可直观反映 MIN6 细胞损伤程度。如图 7 A，蛋白免疫印迹结果所示，单纯高糖持续干预 MIN6 细胞 24 小时即可显著下调抗凋亡标志蛋白 Bcl-2 的表达水平。相较于单一高糖处理，高糖联合棕榈酸的糖脂毒性共刺激可进一步激活凋亡信号通路，显著上调促凋亡蛋白 Bax 及活化剪切型 C-caspase-3 的蛋白表达。与之对应，TUNEL 荧光染色定量分析结果显示，糖脂联合处理组凋亡阳性细胞数量较对照组明显增多 (图 7)[9]。
图 7. 高浓度葡萄糖可诱导 MIN6 细胞凋亡[9]。
表 1. 不同细胞类型的验证要点。
总之，验证糖尿病体外细胞模型是否成功，并非依赖单一指标，而是需要功能、生化、分子多个层面的证据相互印证。无论何种细胞模型，细胞活力下降和凋亡增加是共通的损伤标志；而针对特定细胞的功能验证 (如 β 细胞的 GSIS、胰岛素靶细胞的葡萄糖摄取) 则是判断模型是否真正模拟了糖尿病核心病理的关键。
Section.04
糖尿病模型构建:
常见问题 Q&A
产品推荐：
DMEM (High Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES)
基础培养基
作为巯基供体，可调节细胞氧化还原状态
Fetal Bovine Serum (Superfine), Uruguay
牛胚胎血清，维持体外培养细胞存活
Penicillin-Streptomycin (100×), Steril (HY-K1006)
青霉素和链霉素，可预防细菌污染
0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red可用于细胞解离、常规细胞培养传代
基于 WST-8 的细胞活性/毒性检测
四唑染料，检测细胞还原性代谢
葡萄糖的天然存在形式
甘露醇，可维持渗透压
长链饱和脂肪酸，具有脂毒性
One Step TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)
检测细胞凋亡，绿色荧光
诱导 β 细胞凋亡，可用于糖尿病动物造模
破坏 β 细胞，可用于糖尿病动物造模
参考文献：
[1] Khin PP, et al. Pancreatic Beta-cell Dysfunction in Type 2 Diabetes. European Journal of Inflammation. 2023;21.
[2] Athmuri DN, et al. Experimental diabetic animal models to study diabetes and diabetic complications. MethodsX. 2023 Nov 4;11:102474.
[3] Chen H, et al. Protocol for in vivo and ex vivo assessment of hyperglycemia and islet function in diabetic mice. STAR Protocols, 4
[4] Zhang XT, et al. Baicalin reversal of DNA hypermethylation-associated Klotho suppression ameliorates renal injury in type 1 diabetic mouse model. Cell Cycle. 2020;19(23):3329-3347.
[5] Akinlade OM, et al. Streptozotocin-induced type 1 and 2 diabetes in rodents: a model for studying diabetic cardiac autonomic neuropathy. Afr Health Sci. 2021;21(2):719-727.
[6] Udumula MP, et al. High fructose and streptozotocin induced diabetic impairments are mitigated by Indirubin-3-hydrazone via downregulation of PKR pathway in Wistar rats. Sci Rep. 2021;11(1):12924.
[7] Cheruiyot A, et al. Sustained hyperglycemia specifically targets translation of mRNAs for insulin secretion. J Clin Invest. 2023 Nov 30;134(3):e173280.
[8] Guan G, et al. NFAT5 exacerbates β-cell ferroptosis by suppressing the transcription of PRDX2 in obese type 2 diabetes mellitus. Cell Mol Life Sci. 2025 Jan 29;82(1):64.
[9] Chen Q, et al. ∆nFGF1 Protects β-Cells against High Glucose-Induced Apoptosis via the AMPK/SIRT1/PGC-1α Axis. Oxid Med Cell Longev. 2022 Oct 3;2022:1231970.
