多浸没斜平面光片成像技术实现多尺度生物样品高清三维观测

关键词：斜平面显微镜；多浸没；远程聚焦

光片荧光显微成像能以较低光毒性快速获取生物样品的三维体积图像，但长期分化为多种变体，各自只针对特定样品或成像条件优化，通用性有限。研究提出多浸没斜平面显微镜（multi-immersion oblique plane microscope，miOPM），以任意浸没远程聚焦（any immersion remote focusing，AIRR）理论为基础，配合可连续变倍的远程聚焦中继，使油浸、硅油、水浸与空气等不同浸没介质、相同有效焦距的物镜能在同一台设备上自由互换，在 1.33 至 1.51 的折射率范围内保持衍射极限性能，覆盖从亚细胞动态到模式生物与透明化组织的三维成像。

共同第一作者为 Bingying Chen 与 Alfred Millett-Sikking，通讯作者为 Reto Fiolka，主要合作者包括 Bo-Jui Chang、Stephan Daetwyler、Kevin M. Dean、Sarah Shahmoradian 等。文章题为 “Multi-immersion oblique plane microscope (miOPM): a reconfigurable platform for high-resolution light-sheet fluorescence microscopy”，发表于 Nature Methods ，2026年10月在线发表。

重要发现

任意浸没远程聚焦：让物镜互换成立

斜平面显微镜用同一物镜完成照明与探测，省去了照明、探测物镜的匹配，但下游光路必须与主物镜一一对应：要把倾斜的光片像面映射到相机，中继倍率和光瞳配合都随主物镜变化，换物镜近乎重建整机。

miOPM 由主物镜、次级物镜与管镜构成远程聚焦系统，把样品空间映射到远程空间，再由第三级成像系统把倾斜像面接到相机。AIRR 理论的要点是：发光点位于主物镜标称焦面时波前平坦，离焦时波前弯曲，经次级物镜后曲率反号并重新聚焦；当光瞳放大率等于两处介质折射率之比时像差最小。由此，只要样品到远程空间的横向放大率等于样品折射率与远程空间折射率之比、且角度被等角度映射，三维成像即可在有限深度内保持衍射极限，该深度即远程聚焦范围，与物镜浸没介质无关。

变倍中继是工程核心。传统做法为每种介质定制管镜，折射率一变便需重新装调。miOPM 的变倍镜由三组透镜相对移动，前后焦面固定、保持远心，可在不破坏对准的情况下连续改变倍率，实测覆盖 1.33 至 1.51，也消除了层叠数据在轴向上的非线性拉伸。照明端用柱面元件整形光片，共振振镜抑制阴影，倾角在油、硅油与水浸下取 40 度、空气下取 50 度，体扫描由一对振镜完成。

工作区间有两种：折射率不匹配时，盖玻片须位于标称焦面，成像高度由远程聚焦范围决定；折射率匹配时，样品可沿光轴机械移动，便于大样品做轴向拼接。

油浸物镜：亚细胞尺度

油浸物镜（×40，NA 1.3）对应灵敏度与分辨率最高的模式。以 α-eGFP adaptin 标记网格蛋白包被凹陷，囊泡直径小于 100 nm；原始数据经去斜、旋转与去卷积处理，图像去相关分析给出整叠 77 层切片的横向分辨率为 254 ± 17 nm（均值 ± 标准差）。用膜染料标记 CD8+ T 细胞后，以每秒一个体积采集 300 个时间点，记录到长 100 至 800 nm、直径 300 至 400 nm 的微绒毛在数秒内的形成与运动。HeLa 细胞中同时标记线粒体与线粒体 DNA，三维数据呈清晰点状，结合颗粒追踪可定量观察 DNA 沿线粒体的位移与分裂时的分离。

水浸物镜：扩展样品与冷冻电镜关联

水浸物镜（×40，NA 1.15）的横向分辨率仍在 400 nm 以内，可及体积更大，适合膨胀样品。对膨胀约四倍的肝脏切片，以核酸染料标记细胞核与核仁，沿竖直方向拼接 11 个体数据，覆盖约 609 μm；凝胶界面垂直于光轴，像差较小，按实测 4.05 倍膨胀系数折算，未去卷积分辨率约为 91 nm、83 nm、221 nm（x、y、z），足以三维分辨核仁并完成分割。

同一物镜用于成年小鼠肺来源肺泡II 型上皮细胞的类器官，标记 II 型细胞、线粒体、I 型细胞与细胞核后完成三维成像。在冷冻电镜关联中，原代小鼠纹状体神经元在覆有孔洞碳膜的金网上培养 14 天，网格厚度约 25 μm，带来轴向偏移，水浸物镜的轴向定位仍保证光学切片能力；以膜探针勾画形态、荧光标记的 α- 突触核蛋白预形成纤维追踪摄取，同时成像相邻两个网格方格，随后乙烷急冻并转入电镜，荧光亮点对应神经突起内的纤维状聚集体。

空气物镜：无接触与大体积

空气物镜（×40，NA 0.95）有效数值孔径最低，远程聚焦高度却最大，可获得最大的纯光学扫描体积。对含肝细胞癌的膨胀肝切片，去卷积后可辨线粒体亚细胞器细节，核仁在轴向上清楚分开，堆栈高度约 130 μm，与理论远程聚焦范围相符，全程无机械移动；同样的空气物镜在转盘共聚焦上会产生像差与轴向畸变，miOPM 则不受影响。

对微注射Lifeact–GFP2 的大变形虫，于尾足观察到四个液泡。八孔腔室中，包埋于荧光胶原的胰腺导管腺癌细胞被连续观察 3 小时，其穿行路径上胶原纤维出现富集。在 384 孔板中完成四色体积成像，孔间条件一致、换板迅速，长时间观察不受浸没液面蒸发或扰动限制。

折射率适配：透明化组织

远程空间为空气，变倍镜倍率需直接对准样品折射率。在折射率1.47、填充 100 nm 荧光微球的通道中，倍率停留在 1.33 时顶部成像被球差破坏，调至 1.47 后恢复衍射极限。透明化小鼠脑切片（折射率匹配至 1.47）亦然：倍率 1.33 时质量随深度下降，1.47 时全体积稳定，距表面约 70 μm 的横向切片中，树突棘等细节由模糊变为可辨。校正环只能补偿特定深度上的固定球差，且无法覆盖倾斜像面的整个视场，不能替代这种整体适配。

创新与亮点

论文面对的是彼此牵连的难题：光片显微镜的照明与探测物镜需专门匹配，机械空间限制数值孔径；斜平面显微镜虽只需一个物镜，下游光路却与主物镜绑定，换物镜即重建系统；透明化样品折射率不匹配时分辨力下降并伴随轴向畸变，校正环又无法在倾斜像面上做体积校正。

miOPM 把浸没介质从硬件约束变为可调参数：以 AIRR 理论保证任意介质下的等角度、等倍率映射，用前后焦面固定的变倍中继连续匹配 1.33 至 1.51。同一机身可在油浸下达到 254 nm 量级横向分辨率，在水浸下覆盖数百微米并兼容膨胀样品，在空气下完成 384 孔板四色无接触体积成像，并能衔接冷冻电镜。

其价值落在具体场景：成像平台不必为不同样品购置多台设备，常规样品架与现有透明化流程可直接沿用，高通量筛选、长时程活细胞观察与光电关联实验可在同一台显微镜上完成。

总结与展望

miOPM 的意义不在单项指标，而在把可重构性做成系统能力：同一物镜接口与中继光路即可在亚细胞结构、类器官、模式生物与透明化组织间切换，并把折射率适配纳入常规操作。AIRR 目前假定样品折射率均匀，空间变化的折射率仍需自适应光学，多共轭自适应光学是可行方向；变倍中继也可移植到转盘共聚焦等平台，结合电动化与智能控制实现自动匹配；冷冻温度下的快速三维成像和大规模光电关联工作流，是这套架构有潜力的延伸。

声明：本文仅用作学术目的。 

Chen, B., Millett-Sikking, A., Chang, BJ. et al. Multi-immersion oblique plane microscope (miOPM): a reconfigurable platform for high-resolution light-sheet fluorescence microscopy. Nat Methods 23, 2263–2273 (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41592-026-03245-0