切片之前先看见：Micro-CT如何帮助精准定位样品内部结构

情景导入

到达树脂包埋块内的精确目标通常是超薄切片技术专家面临的最具挑战性的任务。感兴趣的区域可能位于表面下几百微米处，在切割包埋块之前是不可见的。传统策略，如制备半薄切片，并用光学显微镜检查，不仅速度慢，还有可能浪费宝贵的材料。

3D显微CT，通过在修块前绘制包埋块内部图像，克服了这一限制。有了这些体积信息，使得预先定义目标平面并以高精度对齐块面成为可能。

Leica UC Enuity通过其3D修块模块集成了这一功能。通过将显微CT数据与修块工作流程叠加，用户可以直观地看到内部结构，设置参考平面，并让系统计算所需调整的角度。这确保了精确度，提高了可重复性，即使是复杂的标本也能实现可重复的靶向定位。

一个实际的例子就是咽部与肠道交界处的C. elegans按照传统方法，定位这种小组织需要进行多次探查性切割，每次切割都有丢失目标结构的风险。有了UC Enuity和3D Trim功能，就能在显微CT数据中识别出接合点，相应地定位包埋快中的目标点，并以<10 µm的精度找到正确的平面。

本章以10月14号推文内容为基础。介绍了如何使用荧光导向器修整块面。

在这里，显微CT将这种定位功能，延伸到了包埋块内部。在下一篇中，我们回到荧光，这次是在块面水平，以分离单个荧光标记的细胞。

秀丽隐杆线虫嵌入Epon环氧树脂，四氧化锇染色。左图：用于选择目标平面的显微CT数据。右图：在UC Enuity上自动修块。比例尺：500微米。

致谢
作者感谢Yannick Schwab和他的整个团队（德国海德堡EMBL），特别是Kimberly Meecham通过合作和技术转让，将"Crosshair"工作流程，作为三维修块模块，集成到UC Enuity中。
此外，还要特别感谢Felix Gaedke博士（德国科隆CECAD），感谢他制备样品并在许多方面提供知识。
德国科隆遗传学研究所Thorsten Hoppe教授友情提供的elegans。

摘要

本文介绍了如何利用树脂包埋样本的3D显微CT数据，定位并修整至确定的目标平面。
使用徕卡UC Enuity集成的自动化方法，可以节省时间，降低样品损失和减少新用户的培训时间。

简介

电子显微镜，包括透射电子显微镜和扫描电子显微镜（TEM和SEM），被广泛用于对生物标本或无生命材料进行高分辨率的结构观察。超薄切片技术是为TEM/SEM获取小于100纳米的超薄切片的主要技术。

分析时间：在室温下制备样品时，将小块样品嵌入环氧树脂或丙烯酸树脂中。然后通过修块去除多余的树脂，暴露标本，并使用玻璃刀或金刚石刀将标本切成超薄切片（50 nm - 100 nm）。

修块过程对于去除不含样品的多余树脂、暴露标本，以及创建一个包含用于后续切片的感兴趣区域或细胞的块面至关重要。

在目前的标准工作流程中，并非总能使用超薄切片机上的标准体视显微镜直接识别实际的目标区域。取而代之的是，对示例性的（半薄）切片进行染色，例如用甲苯胺蓝，并转移到外部光学显微镜以确定是否已达到标本的目标平面。

随后，需要在超薄切片机上进行繁琐的调整，以确保后续的精确切片，而不损失样品。

为了避免这些高风险，且费时费力来回调整切片的工作，一种安全、自动接近目标平面的方法将受到电子显微镜领域的高度重视。这也将使缺乏经验的用户能够安全、高效地接近感兴趣的平面。

挑战

要开发这样一种方法，将面临着三个挑战。首先是将树脂中的目标结构可视化。其次，必须定义目标微调平面的位置，及其与参考平面的相对深度、俯仰角和偏航角等所有参数。第三，超薄切片机必须能够进行视觉选择，然后设置好所有参数，并自动接近目标。

在这篇文章中，我们展示了这些挑战如何通过包含自动超薄切片机UC Enuity的工作流程得到解决。

为了用生物样本来证明这一概念，我们想到了线虫中的一个著名结构，即位于咽和肠道交界处的咽后区，即所谓的咽肠瓣（VPI，图1）。

用高压冷冻法制备秀丽隐杆线虫，然后用四氧化锇进行轻度反差增强的冷冻替代，并将其嵌入Epon环氧树脂中。

图1：elegans顶端部分示意图。

目标的可视化

一种可视化树脂内部结构的非破坏性技术是使用X射线计算机断层扫描（CT）。对于像电子显微镜标本这样的小样本，可以使用更小的微型计算机断层扫描（micro-CT）。在micro-CT中，样品被安装在一个可旋转的柱子上，在以特定角度旋转时暴露在X射线下。样品吸收并散射光线，从样品中射出的射线束被探测器（例如sCMOS相机）记录。

由此产生的一系列旋转图像被渲染成3D图像，仅凭树脂内微小的密度和组成差异，即可用于可视化树脂内不可见的结构。

在这里，用眼睛就能看到树脂块中的秀丽隐杆线虫标本，因为它在包埋前用四氧化锇进行了固定和染色（图2）。然而，仅使用安装在超薄切片机上的体视显微镜进行精确的3D靶向定位，如果不采用制备半薄切片的繁琐方法，是不可能的。此外，由于蜗杆是弯曲的，并不垂直于预修剪表面，因此很难手动实现目标平面的完美截面。

因此，使用显微CT设备（布鲁克公司，Skyscan 1270 MicroCT）对样品进行记录，以显示样品轮廓（图3）。我们的想法是靶向线虫的末端球茎，使其尽可能靠近咽和肠之间的过渡区。

图2：嵌入Epon环氧树脂的线虫，经四氧化锇染色。树脂块由人工预先修整。比例尺：500微米。

预修剪

在任何精确的切片步骤之前，需要对样品进行修块，以获得包围标本的包埋材料的形状，从而增加切片过程中的稳定性，并去除多余的必要树脂，以获得良好的显微CT图像。

通常，这是在体视显微镜下用手术刀片手动完成的。一般而言，标本周围的最终形状是截去顶端的棱锥形（图2）。使用显微CT进行靶向定位时，这个平台尤为重要，因为它被用作参考平面，以将超薄切片机屏幕上的样品轮廓与实际安装在其上的“真实世界”标本对齐。

定义参考平面和目标平面

要确定基准面和目标面，关键是不仅要描绘样品，还要选择性地显示周围的树脂。这样就可以将超薄切片机屏幕上三维数据集中选择的目标平面，与实际“真实世界”中的目标平面联系起来（图3）。

Leica UC Enuity允许加载不同格式（如DICOM、XRM、TIFF、JPEG等）的显微CT数据。

图3：在UC Enuity的3D修块模块中，打开的显微CT扫描数据。左图：以“图块”模式显示数据，以显示图块轮廓。右图：样本以“样本”模式显示，以增强嵌入样本的效果，便于定位。比例尺：500微米。

参考平台的定义是通过交互方式，将图像中的3个点移动到样品的前方，即所提到的平面。借助3D查看器和旁边的横截面显示屏，可以轻松创建参考平面（图4）。定义参考顶面后，就可以配置实际的目标平面了（图5）。

图4：定义参考平面表面。在此工作流程中，将以交互方式设置参考平面的表面，该表面是稍后修块的起点。样品可在左侧面板中进行三维旋转，右侧显示通过该点的横截面。通过在所有维度上将蓝点移动到其位置来标记顶面。

图5：UC Enuity的3D Autotrim模块截图。工作流程“切割平面”。左侧显示显微CT数据显示在三维浏览器中。设定的切割平面显示为绿色。俯仰角和偏航角，可通过触摸屏或鼠标进行交互式定义。右侧显示屏：切割面横截面图箭头所示为终末球茎的中空结构。

目标平面由绿色平面表示，其俯仰角和偏航角，可以在左侧的3D查看器中定义。右侧显示屏显示切割平面的剖面图，便于找到感兴趣的结构。在到达咽部末端时，我们试图定位后球部末端，以确保不会失去咽肠瓣膜。为此，我们调整了切割平面，使其位于xy显示屏中，后球茎内，这在xy显示中可见为一个中空结构（图5）。

自动修块

点击“Adjust（调整）”确认设置后，UC Enuity会自动配置刀具、样品倾斜和样品旋转角度（图6）。然后，可以定义修块速度和厚度，并启动程序。全自动修块将时间反馈给用户，让以便提前准备下一步或其他事情。

图6：UC Enuity的3D Autotrim模块截图。左图：最后一步“调整”。点击“调整”，刀具和样品将根据之前互动步骤中设置的切割平面进行旋转。右图：90°修块刀和样块在调整后的相互关系如图所示。为安全起见，调整工作应在与样品保持安全距离的情况下进行。规模尺寸：刀宽为4毫米。

结果

自动修块后，所得样品的图像，与“切割平面”窗口的图像的叠加图（图7）。上述并排图像结果，证明自动定位修块方法是成功的。通常情况下，修块精度可以小于10微米。

在自动修整目标平面后，对块面的第一部分制备了超薄切片，并收集在电镜载网上。图中显示的为，用醋酸铀和柠檬酸铅染色后，第一张切片的TEM图像。图像结果表明，咽部和肠道之间的过渡区清晰可见，证实使用UC Enuity的自动定位修块方案设置角度和修块深度的准确性。

图7：交互式显示屏和修块后样品的并排视图。比例尺：500微米。

图8：自动修块后线虫切片的TEM图像。咽-肠瓣膜用白色方框标出。比例尺：10微米。图片由德国科隆CECAD的Felix Gaedke慷慨提供。

总结

在这篇文章中，我们了解到显微CT数据可用于UC Enuity，以准确定位树脂块中的特定感兴趣平面。显微CT数据可载入UC Enuity软件，并以交互方式确定目标平面。仪器负责自动调整刀具和样品参数。这有助于减少在深度修块过程中，对半薄切片进行繁琐的反复检查，便于从特定角度切割样品，并为用户腾出时间开展其他工作。

工作流程的主要启示

• 显微CT显示内部结构埋藏在表面下数百微米处的结构，如线虫的咽肠交界处，很难用传统方法进行定位。显微CT可提供区块内部的结构信息，准确显示目标位置，无需进行盲目的探索性切割。这样既能提高效率，又能保护不可替代的标本。
• 参考平面可实现重现性。提前定义切割平面，并相应调整树脂块的方向，可确保切割面与相关目标对齐。3D修块模块可计算所需调整的俯仰角和偏航角，减少对操作员经验的依赖性。这种可重复性对于研究和培训工作都至关重要。
• 该系统可减少错误。手动修块在很大程度上依赖于操作员的判断，而且经常需要反复试验和也容易出错。UC Enuity可自动进行角度计算，确保刀和树脂块第一次就能正确定位。这不仅节省了时间，还降低了因不必要的切割，而丢失目标区域的风险。
• 高精度保护样品。经C. elegans实验验证，UC Enuity可实现<10 µm的修块精度，确保暴露目标点，并最大化降低浪费样品。这种精度对于小型或易碎样品至关重要，因为每切割一次都会减少可用材料的数量。
• 支持光电联用工作流程。显微CT数据可直接与电镜切片对齐，从而在体机成像和超微结构细节之间，架起一座桥梁。这种集成性在光电联用工作流程中尤为有用，在这种流程中，因为背景数据与高分辨率成像同样重要。
• 适用于从简单到复杂的目标。初学者可以从简单的目标开始学习工作流程，而经验丰富的用户则可以将其应用于日益复杂的工作中。相同的原理适用于各种类型的样品，因此该方法用途广泛，适用性强。

Vanessa Zheden博士

Institute of Science and Technology

Austria (ISTA),Klosterneuburg,Austria

我有机会使用了新的UC Enuity，电动刀架和电动弧形样品夹，给我留下了特别深刻的印象。这些功能可实现小角度的精确调整，并将样品精确地旋转到规定角度。另一个值得注意的功能是自动修块功能，它对初学者特别有帮助，因为初学者可能很难将样品对准刀锋。虽然有经验的用户手动对齐样品的速度可能更快，但自动修块功能仍然可以节省时间，让他们可以专注于其他任务。新的UC Enuity将简化切片过程。

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