蛋白纯化洗脱杂蛋白多的原因与排查方向
洗脱杂蛋白多，意思是抓目标蛋白时把一堆无关蛋白也一起带下来了，产物纯度不达标。原因先摆出来，再对症下药。
杂蛋白从哪来的
一是结合特异性不够：填料对目标蛋白的捕获本来就带一点“眉毛胡子一把抓”，尤其是样品特别杂的时候。二是洗涤不充分：没结合牢的杂蛋白没被冲掉，跟着目标一起下来。三是上样量超载：柱子结合位点被占满后，多余的杂蛋白直接穿透到收集管。四是样品本身的问题：裂解不充分、粘度高、核酸没去除，都会让背景变浑。
针对性解决的思路
提高特异性：换结合更专一的填料，或者加一步前置纯化先把大头杂质去掉。充分洗涤：增加洗杂体积，或者在洗涤缓冲液里加少量温和试剂，把结合不牢的蛋白冲下来。控制上样：按填料结合容量计算上样量，别贪多。处理样品：裂解完全、离心去碎片、用核酸酶或沉淀法去掉核酸。
预防比补救省事。正式纯化前先做小试，摸出洗涤体积和上样上限，放大时按比例走，能避开大部分杂质问题。
Q：杂蛋白多和填料有关系吗？
A：有，但通常是第二位的原因。先排查上样量和洗涤，再考虑换填料。
Q：加一步前置纯化值得吗？
A：样品特别杂时值得。一步粗分能把背景降下来，后面的精细纯化反而更稳。
杂蛋白从哪来的
一是结合特异性不够：填料对目标蛋白的捕获本来就带一点“眉毛胡子一把抓”，尤其是样品特别杂的时候。二是洗涤不充分：没结合牢的杂蛋白没被冲掉，跟着目标一起下来。三是上样量超载：柱子结合位点被占满后，多余的杂蛋白直接穿透到收集管。四是样品本身的问题：裂解不充分、粘度高、核酸没去除，都会让背景变浑。
针对性解决的思路
提高特异性：换结合更专一的填料，或者加一步前置纯化先把大头杂质去掉。充分洗涤：增加洗杂体积，或者在洗涤缓冲液里加少量温和试剂，把结合不牢的蛋白冲下来。控制上样：按填料结合容量计算上样量，别贪多。处理样品：裂解完全、离心去碎片、用核酸酶或沉淀法去掉核酸。
预防比补救省事。正式纯化前先做小试，摸出洗涤体积和上样上限，放大时按比例走，能避开大部分杂质问题。
四类来源对应四类解决思路
FAQQ：杂蛋白多和填料有关系吗？
A：有，但通常是第二位的原因。先排查上样量和洗涤，再考虑换填料。
Q：加一步前置纯化值得吗？
A：样品特别杂时值得。一步粗分能把背景降下来，后面的精细纯化反而更稳。
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