靶向猴痘病毒A35R蛋白的中和抗体的筛选与结构表征

来自深圳三院、深圳理工大学、国科大杭州高等研究院和复旦大学的联合研究团队共同合作完成了猴痘病毒中和抗体的筛选、功能表征与结构研究工作，研究成果于近期发表于MedComm杂志。

一、引言

猴痘病毒（mpox virus，MPXV）隶属于痘病毒科正痘病毒属。2022 年 IIb 分支、2024 年 Ib 分支毒株相继引发全球猴痘暴发，世界卫生组织两年内两度将其列为国际关注的突发公共卫生事件。截至 2025 年 11 月 30 日，全球 142 个国家和地区累计报告 175415 例确诊病例、467 例死亡病例，该病毒对免疫功能低下人群可造成重症感染，公共卫生风险突出。

现有猴痘防控手段存在显著局限，ACAM2000、JYNNEOS 等天花类疫苗存在不良反应，不适用于脆弱人群；已获批抗痘病毒药物替考韦马特对 I 分支 MPXV 感染的疗效有限；目前尚无猴痘特异性单克隆抗体进入临床试验。

MPXV 存在细胞成熟病毒（IMV）、细胞外囊膜病毒（EEV）两种感染颗粒，其中 EEV 是介导病毒在宿主体内细胞间扩散的关键形式，其表面 A35R 蛋白是理想免疫靶点。既往研究发现，数十年前接种天花疫苗人群体内仍可检测到长效 A35R 结合抗体，提示该抗原可诱导持久免疫记忆。但猴痘 A35R 与牛痘病毒 A33R 存在序列差异，会造成抗体交叉识别失效，且现有 A35R 靶向抗体的精准表位与中和分子机制尚不明确。传统杂交瘤筛选、康复者血清分离抗体技术流程冗长、效率偏低。本研究依托 mRNA-LNP 免疫联合 Beacon®单细胞光导平台快速筛选靶向 A35R 蛋白的单克隆抗体，从中筛选最优克隆 17H1，从体外结合能力、体外中和活性、体内保护效力、冷冻电镜复合物结构四个维度系统解析其抗病毒分子基础，为猴痘被动免疫治疗提供候选分子。

二、研究结果

（一）Beacon®筛选靶向A35R的单抗

采用间隔 3 周的免疫程序，对 BALB/c 小鼠肌肉注射 5 μg A35R-Fc mRNA-LNP 完成初免与加强免疫；加强免疫后筛选血清抗体滴度高于 10⁶的小鼠，于三免 5 天后分离脾脏细胞。通过磁珠负选富集总 B 细胞、正选获得 CD138⁺抗体分泌浆细胞，利用 Beacon®单细胞光导平台完成抗原特异性B细胞筛选。扩增抗体轻重链可变区（VH/VL）基因，将鼠源可变区与人 IgG1 恒定区载体重组，转染 HEK293F 细胞表达纯化，最终获得 5 株特异性单抗：1H4、3H3、3H6、13H1、17H1。

图1：基于Beacon®单细胞光导平台的A35R特异性单抗筛选流程。

基因测序结果显示 5 株抗体重链均由 IGHV1 胚系基因编码；17H1 轻链胚系基因为 IGKV14。各抗体轻重链体细胞超突变频率适中，HCDR3 长度区间为 8–19 个氨基酸，κ 链 CDR3 均为 9 个氨基酸，符合功能性中和抗体特征。流式细胞术检测证实 5 株抗体均可特异性识别 HEK293T 细胞表面全长 A35R 蛋白；其中 17H1 细胞结合阳性比例显著高于其余 4 株抗体以及商业化阳性对照抗体。

（二）体外功能验证：17H1 具备高亲和力与补体依赖性强效中和活性

ELISA 检测显示 5 株抗体结合 A35R 的 EC₅₀介于 2.82~8.26 ng/mL。表面等离子共振（SPR）动力学检测证实 17H1 平衡解离常数 KD仅 0.09 nM，达到皮摩尔级超高亲和力，优于其余 4 株抗体及已报道交叉中和抗体 A27D7（KD=2.31 nM）。竞争 SPR 实验表明 17H1 与 A27D7 识别表位存在部分重叠，但 17H1 结合能力更强。

图2：采用ELISA和SPR测定5株单抗与A35R蛋白的结合能力。

采用病灶减少中和试验（FRNT）以活 MPXV 开展中和检测。补体存在条件下，17H1 中和半数病毒的 IC₅₀为 259.3 ng/mL，中和效力为 5 株抗体最优；缺失补体时，全部抗体在 10 μg/mL 最高测试浓度下均无中和效果，证实 EEV 靶向抗体的中和功能严格依赖补体通路。

（三）致死 MPXV 攻毒小鼠模型证实 17H1 兼具预防、治疗完全保护作用

构建鼻内致死剂量 MPXV 感染 BALB/c 小鼠模型，分别评价 17H1 的预防与治疗效力。

攻毒前 24 h 腹腔注射 1 mg/kg 17H1，同型 IgG 为空白对照。14 天观察周期内 17H1 组小鼠存活率 100；对照组小鼠 6 天内全部达到人道终点（体重下降超 25%）。感染第 5 天肺组织病毒载量检测显示，17H1 组病毒 DNA 载量（7.94 log₁₀）较对照组（10.79 log₁₀）显著降低，肺部组织病理损伤明显减轻。

图3：17H1 抗体对MPXV感染的预防保护效力。

小鼠鼻内攻毒 24 h 后腹腔注射 5 mg/kg 17H1 干预。17H1 处理组小鼠全程体重稳定、100% 存活；IgG 对照组全部于第 6 天死亡。肺组织定量 PCR 结果显示，17H1 可将肺部病毒载量降低超 1000 倍，肺组织炎症、坏死病理改变大幅缓解。

图4：17H1 抗体对MPXV感染的治疗效力。

体内实验证明，单独使用 17H1 即可完全抵御致死剂量 MPXV 感染，显著抑制肺部病毒复制与组织病变。

（四）冷冻电镜解析 17H1-A35R 复合物独特中和结构机制

本研究解析分辨率 3.63 Å 的 MPXV A35R 胞外域-17H1 Fab 复合物冷冻电镜结构，阐明强效中和的分子机制。

A35R 天然以同源二聚体形式存在，单体包含 3 段 α 螺旋、3 条 β 折叠；其核心保守区（99–181 位氨基酸）与牛痘 A33R 高度同源，二者 Cα RMSD 仅 0.7 Å；蛋白 N 端 57–98 位柔性区域无稳定电子密度，结构高度可变。

一分子 A35R 二聚体可结合两分子 17H1 Fab 片段，Fab 与二聚体平面夹角约 20°，靶向二聚体远端构象表位，区别于既往结合二聚体中央凹槽的抗体。

图5：结合 17H1 Fab的猴痘病毒 A35R 蛋白冷冻电镜结构。

抗原-抗体界面相互作用以重链为主，重链埋藏表面积 498 Ų，轻链埋藏表面积 289 Ų。核心相互作用为 17H1 CDRH3 的 R9 残基与 A35R 关键残基 E120 形成 3 组盐桥，同时搭配多条氢键、疏水作用共同稳定复合物；该表位为构象依赖型，不同于已报道线性 A35R 表位抗体。

序列保守性分析显示 Ib、Ia、IIb、IIa 四类主流 MPXV 分支的 A35R 同源性＞98%，E120 关键位点完全保守，提示 17H1 对当前流行毒株具备广谱交叉中和潜力。

三、讨论与结语

全球猴痘持续人传人流行，现有疫苗与药物存在适用人群、疗效短板。EEV表面A35R蛋白是极具开发价值的抗病毒靶点，但此前缺少亲和力高、中和机制清晰的治疗性单抗。本研究搭建 mRNA-LNP 免疫联合Beacon®单细胞光导平台的快速高通量抗体发现实验流程，克服传统杂交瘤筛选周期长、重组蛋白免疫原性不足的缺陷，快速获得多株功能性中和抗体，其中 17H1 综合性能最优。

体内动物实验证实，单一17H1给药即可实现致死MPXV攻毒小鼠完全防护，无需联用靶向IMV的抗体，同时具备暴露前预防、暴露后治疗双重应用前景。冷冻电镜结构揭示 17H1识别二聚体远端全新构象表位，依靠E120介导多重分子相互作用实现超高亲和力，从结构层面解释其强效中和能力。A35R在各MPXV谱系高度保守，预示17H1可覆盖当前主流流行分支Ib、IIb毒株。

综上，本研究筛选得到的17H1是靶向MPXV A35R蛋白极具潜力的候选治疗性中和抗体。解析的抗原-抗体精细复合物结构，为广谱抗猴痘病毒单抗的改造、新型疫苗抗原设计提供关键结构依据，为全球猴痘疫情防控提供全新被动免疫干预思路。

参考文献

S. Bai, S. Song, X. Wang, et al. “Discovery and Structural Characterization of a Highly Protective Neutralizing Antibody Targeting the Mpox Virus A35R Protein.” MedComm 7, no. 7 (2026): e70804. https://doi.org/10.1002/mco2.70804

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