Cre-Lox解析:基因敲除小鼠条件性打靶、CreER诱导与Find CRE工具鼠
Cre-Lox系统是构建基因敲除小鼠和条件性基因操作的核心工具，通过Cre重组酶与loxP位点的特异性识别，可实现基因的时空特异性敲除或表达。本文系统介绍Cre-Lox系统的基本组件（Cre重组酶、loxP位点及突变体）、三种重组事件（删除、倒转、易位）、体内基础应用（条件性表达与条件性敲除）、诱导型系统（CreER他莫昔芬诱导、Tet-On/Tet-Off四环素诱导），并展示南模生物超过600种自主产权Cre/Dre工具小鼠库及Find CRE工具鼠搜索系统，附Alb-CreERT2肝脏验证和Pvalb-Cre神经元验证数据。
1. 什么是 Cre-Lox 系统？
Cre-Lox 系统由 Cre 重组酶和 loxP 位点两部分组成。
Cre 重组酶
Cre 重组酶由噬菌体 P1 的环化重组酶基因产生的一个 38 kDa 的 DNA 重组酶，能特异性地识别 loxP 位点，实现 DNA 片段的重组。除 Cre 以外，此类重组酶还有 Flp（flipase）和 Dre（D6 特异性重组酶）。
Lox 位点
lox 位点是一个 34 bp 的序列，由两个 13 bp 的反向回文重复序列和 8 bp 的中间间隔序列组成：
ATAACTTCATGTA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT
N 表示可变碱基，不同的碱基选择可形成不同的 Lox 位点。除了野生型 loxP，常见的还有 Lox2272、Lox511、Lox5171 等。这些突变 Lox 位点也能被 Cre 重组酶识别，但只有两个序列相同的 Lox 位点之间才能发生重组。
图1. loxP 位点及其突变体位点
根据 lox 位点的排列方向和位置，Cre 重组酶能介导片段发生三种重组事件：
· 删除（Deletion） 两个 Lox 位点在同一染色体上且方向相同时，两个 Lox 位点之间的序列将被删除。
· 倒转（Inversion） 两个 Lox 位点位于同一染色体上且方向相反时，两个 Lox 位点之间的序列将发生序列倒转。
· 易位（Translocation） 两个 Lox 位点位于不同的染色体上且方向相同，将导致 2 条染色体上 DNA 片段的交换。
A）loxP 位点的基本结构。红色箭头指示 loxP 位点的方向。B）Cre-loxP 介导的易位重组。C）左图示 Cre 介导两同向 loxP 位点间的切除重组。右图示 Cre 介导两反向 loxP 位点间的反转重组。
2. 体内 Cre-Lox 系统的基础应用
利用 Cre-Lox 系统在小鼠体内实现对基因的时空特异性打靶（表达或敲除），原则上需要建立两种小鼠：
· Cre 工具小鼠 携带 Cre 重组酶的基因修饰小鼠。Cre 重组酶由特定启动子驱动，可在特定细胞或组织中表达。
· Flox 小鼠 在靶基因序列两侧插入 Lox 位点的基因修饰小鼠。
通过将上述两种小鼠交配繁育，即可获得基因条件性敲除或过表达小鼠。
2.1 基因条件性表达
在基因条件性表达中，Flox 小鼠的靶基因与启动子之间通常插入了一个"终止盒"（lox-stop-lox-GENE）。该元件能阻止靶基因的转录和表达。
将 Flox 小鼠与细胞类型特异性表达 Cre 的工具小鼠交配所获得的子代小鼠中，所有表达 Cre 重组酶的细胞，stop 元件会被删除。因此，靶基因仅在这些特定细胞中得以表达。
在基因条件性敲除中，Flox 小鼠一般在需要删除的 DNA 片段两侧带有同方向的两个 Lox 位点（lox-GENE-lox）。
将 Flox 小鼠与细胞类型特异性 Cre 小鼠交配所获得的子代小鼠中，所有表达 Cre 重组酶的细胞，该 DNA 片段会被删除，从而实现组织特异性的基因敲除小鼠表型。这种条件性基因敲除小鼠相比全身基因敲除小鼠，可以避免胚胎致死等问题，更精准地研究基因在特定组织中的功能。
为更准确地进行遗传功能研究，时间特异性的 Cre-Lox（诱导型 Cre-Lox）被开发出来，可用于研究生物体发育过程特定阶段的基因功能，或用来进行谱系示踪等。
3.1 CreER 系统
通过他莫昔芬（Tam）诱导 Cre 酶的重组活性：
· 未诱导状态 CreER 融合蛋白与热休克蛋白 90（HSP90）相互作用并存在于细胞质中。
· 给药后 他莫昔芬破坏 HSP90 与 CreER 的相互作用 → ER 与 Tam 的相互作用诱导 Cre 的核易位 → 在细胞核中 CreER 识别 loxP 位点并使组织 X 中的基因 Y 失活。
CreERT2 在体内对药物诱导的敏感性更高，因此一般优选使用 CreERT2。
四环素诱导系统，也叫强力霉素（Dox，四环素衍生物）诱导的 Cre 系统。该系统有两种模式：
· Tet-On 系统：Dox 给药才能打开 Cre 表达 在没有 Dox 的情况下，失活的 rtTA 无法与负责调控 Cre 基因的 TRE 序列结合，Cre 不表达。Dox 给药后，Dox 结合并激活 rtTA → 激活的 rtTA 与 TRE 序列结合并诱导 Cre 表达。
· Tet-Off 系统：Dox 给药后关闭 Cre 表达 在没有 Dox 的情况下，激活的 tTA 能够结合 Cre 前的 TRE 序列并诱导 Cre 表达。Dox 给药后，与 Dox 相互作用的 tTA 被灭活 → 灭活的 tTA 不再与 TRE 结合 → Cre 表达受到抑制。
Dox 通常在小鼠的饲料或饮水中进行给药。
南模生物可提供超过 600 多种自主产权 Cre/Dre 工具小鼠，覆盖全身各类型的细胞组织，满足科研人员多样化的需求。目前已经完成了 200 多种 Cre/Dre 工具小鼠的验证工作。
· Find CRE工具鼠搜索系统 南模生物特别定制了Find CRE工具鼠搜索系统，界面以小鼠组织、器官和系统为主线，可分为肺、肝、胃肠道、乳腺、胰腺、感觉器官、心血管系统、免疫系统、神经系统、泌尿生殖系统、骨骼肌系统以及其他组织器官。选择感兴趣的组织器官，就可以查看该组织下可用的 Cre 工具小鼠。
部分 Cre 品系验证数据
① Alb-CreERT2
Alb-CreERT2 小鼠是研究肝脏基因功能与疾病的重要工具小鼠品系，验证数据证明 Alb-CreERT2 小鼠可以成为实现肝脏时间特异性敲除或表达的工具。
未使用他莫昔芬诱导的小鼠，肝细胞未被染色；使用他莫昔芬诱导的小鼠，肝细胞成功着色。
Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ 小鼠被他莫昔芬诱导后，LacZ（红色）表达。
结果显示 Alb-CreERT2 小鼠与野生型小鼠相比肝功能正常。
② Pvalb-Cre
Pvalb-Cre 在中间神经元中表达 iCre 重组酶，而不干扰内源性 Pvalb 表达。这些小鼠可能对研究神经元分化有重要作用。
结果显示：双阳性小鼠海马中间神经元有 tdTomato 的表达，表达类型符合预期。
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参考文献
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上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于 2000 年 9 月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。
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