常用蛋白-蛋白互作检测技术的原理、步骤及优缺点总结整理
一、检测蛋白和蛋白体内相互作用
体内检测的优点：
· 最接近生理真实状态；
· 可验证内源天然蛋白互作；
体内检测的缺点：
· 可能是间接互作；
· 实验干扰多，内源蛋白少可能检测不到；
· 难以检测结合亲和力和动力学
1、 免疫共沉淀Co-IP
技术原理：ProteinA/G琼脂糖珠&磁珠连接的靶蛋白抗体拉取内源靶蛋白，将与其结合的互作蛋白一同沉淀下来，然后通过WB检测互作蛋白；
为什么ProteinA/G琼脂糖珠&磁珠可以连接抗体？
ProteinA/G琼脂糖珠&磁珠上面偶联有ProteinA/G蛋白，ProteinA蛋白来自于金黄色葡萄球菌，ProteinG蛋白来自于链球菌，主要结合抗体的Fc区域；
简要步骤：
· 细胞裂解提取总蛋白
· 加入靶蛋白抗体孵育结合
· 加入 Protein A/G 琼脂糖珠或者磁珠结合抗体
· 离心洗涤或者磁力架洗涤去除非特异性结合蛋白
· 煮沸蛋白，WB 检测互作蛋白
核心试剂：
Co-IP一抗（CST品牌&Starter品牌）
WB一抗（CST品牌&Starter品牌）
Co-IP试剂盒（Absin品牌：abs955&abs9649）
Protein A/G琼脂糖珠&磁珠（Santa品牌：sc-2003；Cytiva品牌：17061801）
为什么选这个技术？
最经典内源验证，贴合生理状态；
技术方案成熟；
文献通用；
不需要复杂仪器；
有什么局限性？
只能证明体内存在相互作用，无法区分直接/间接结合；
易有非特异结合；
弱互作难检出；
无法检测亲和力和动力学；
结合强弱比较只能通过条带深浅观察，没有具体数值；
部分相关产品
| 货号 | 名称 | 规格 |
| 4060S | Phospho-Akt (Ser473) (D9E) Rabbit Monoclonal Antibody | 20ul/100ul |
| 4370S | Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Rabbit Monoclonal Antibody | 20ul/100ul |
| abs955 | 免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒 | 50T |
| abs9649 | 免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒（磁珠法） | 50T |
| sc-2003 | Protein A/G PLUS-Agarose | 2ml |
| 17061801 | PROTEIN G SEPHAROSE 4 FF, 5 ML | 5ml |
| 17127901 | RPROTEIN A SEPHAROSE FF 5 ML | 5ml |
| abs920 | ECL化学发光检测试剂盒 | 25mlx2 |
2、酵母双杂交 Y2H
技术原理：
把需要检测的其中一个蛋白构建至BD-载体，另一个蛋白构建至AD-载体，共同转化至酵母中。如果两个蛋白有相互作用，BD结构域和AD结构域互相靠近重新恢复转录活性，激活下游报告基因表达。
除了检测两个蛋白是否有相互作用，这种方法也常用于筛选哪些蛋白和已知蛋白有相互作用，此时需要使用酵母双杂交cDNA文库，酵母cDNA文库里面包含大量AD-未知蛋白，把已知蛋白构建到BD载体上，通过酵母双杂交进行互作筛选之后，再通过测序鉴定互作蛋白。
BD和AD是什么？
BD和AD都是转录因子的两个结构域，BD是DNA结合域，AD是转录激活结构域，只有两者靠近才能共同发挥转录因子的作用，激活下游基因转录。
下游常用哪些报告基因？
1、HIS3&LEU2：组氨酸合成基因和亮氨酸合成基因，这两个基因表达以后，酵母才能在缺失组氨酸和亮氨酸的培养基上生长；
2、LacZ：β- 半乳糖苷酶基因，这个基因表达之后，在含有X-gal的培养基生长时，β- 半乳糖苷酶会水解X-gal底物，生成蓝色不溶性产物，表现为菌落变蓝；
简要步骤：
· 构建 BD 和AD 质粒
· 共转化酵母感受态细胞
· 缺陷型培养基或者蓝白斑筛选阳性酵母
· 测序鉴定互作蛋白
核心试剂：
酵母感受态细胞、pGBKT7质粒（BD-质粒）、pGADT7质粒（AD-质粒）
为什么选这个技术？
体内生理状态；
适合高通量未知互作蛋白筛选，可建文库大规模筛选
不需要复杂仪器；
有什么局限性？
酵母异源表达，无高等动物翻译后修饰；
假阳性较高；
难以定量检测，无法检测亲和力和动力学；
部分相关产品
| 货号 | 名称 | 规格 |
| abs60619 | 快速多片段DNA无缝克隆试剂盒 | 50T |
| abs60296 | 小量高纯去内毒素质粒提取试剂盒 | 50T |
| abs923 | 预染蛋白Marker（10-245KDa） | 500uL |
| abs60246 | 逆转录一管化三代预混液 | 100T |
| abs9181 | GelRed核酸染料 | 1ml/1ml*5 |
3、邻近连接实验 PLA
技术原理：
通过一对标记寡核苷酸(单链DNA)的抗体探针，识别待测的两个蛋白，如果两个蛋白有相互作用，两个探针之间的距离靠近，加入DNA连接酶之后会形成DNA circle。然后通过加入DNA聚合酶，进行滚环扩增；再加入荧光探针，和目标单链DNA结合，通过荧光显微镜检测是否有荧光，表明蛋白互作。
什么是PLA二抗？
PLA二抗是共价连接有一段单链DNA寡核苷酸的抗体，可以和对应一抗特异性结合，如果两个蛋白间距小于40nm时，配对的两个PLA二抗上面的DNA可拼接环化。
什么是滚环扩增？
使用phi29 DNA聚合酶，在37℃的条件下，围绕着环状模板进行滚环复制，恒温条件即可进行。
简要步骤：
· 样本固定和封闭
· 孵育两种靶蛋白一抗
· 加入PLA二抗
· 连接反应（加入DNA连接酶，形成DNA circle）
· 滚环扩增（加DNA聚合酶，进行滚环扩增）
· 加荧光探针，和DNA结合
· 封片，荧光显微镜观察
核心试剂：
一抗（CST品牌&Starter品牌）
PLA试剂盒（Navinci品牌）
为什么选这个技术？
原位检测内源互作
荧光可视化定位检测
灵敏度极高
有什么局限性？
成本相对较高；
无法检测亲和力和动力学；
部分相关产品
| 货号 | 名称 | 规格 |
| 3287S | ROS1 (D4D6) Rabbit Monoclonal Antibody | 20ul/100ul |
| 9145S | Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) Rabbit Monoclonal Antibody | 20ul/100ul |
| 60025 | NaveniFlex Cell MR RED | 1 kit |
| 60017 | NaveniFlex Cell MR Atto647N | 1 kit |
| 60027 | NaveniFlex Tissue MR RED | 1 kit |
| 60026 | NaveniFlex Tissue MR Atto647N | 1 kit |
| abs9170 | 4%多聚甲醛 | 500ml |
| abs9248 | 柠檬酸钠抗原修复液（50x） | 100ml |
| abs7187 | 多聚赖氨酸粘附载玻片 | 50片 |
4、双分子荧光互补 BiFC
技术原理：
和酵母双杂交类似，只不过是使用分段的荧光蛋白基因。将荧光蛋白拆成两段，一般使用YFP荧光蛋白，把需要检测的其中一种蛋白构建至带有YFP N端序列（1-172）的载体上，另一个蛋白构建至带有YFP C端序列（155-238）的载体上，然后共转染至细胞内。如果两个蛋白有相互作用，会拉进YFP两个结构域重新组装成完整的YFP蛋白空间结构，受到激发后发出荧光。
N端YFP和C端YFP蛋白本身不发光？
N端YFP和C端YFP是YFP蛋白的两个结构域，本身不发光。只有互相靠近折叠组装成完成YFP蛋白空间结构后，经激发后才会产生荧光。
简要步骤：
· 构建两段荧光标签融合表达载体
· 共转染哺乳动物细胞
· 培养表达后激光共聚焦显微镜观察荧光
核心试剂：
YFP标签表达载体
转染试剂（polyplus品牌）
为什么选这个技术？
可视化原位互作，定性直观；
可确定互作亚细胞定位；
保持真实胞内环境；
有什么局限性？
荧光片段拼接不可逆，易出现假阳性；
难以定量互作强度
无法检测亲和力和动力学
部分相关产品
| 货号 | 名称 | 规格 |
| 101000046 | jetPRIME | 1.5ml |
| abs60619 | 快速多片段DNA无缝克隆试剂盒 | 50T |
| abs60296 | 小量高纯去内毒素质粒提取试剂盒 | 50T |
| abs923 | 预染蛋白Marker（10-245KDa） | 500uL |
| abs60246 | 逆转录一管化三代预混液 | 100T |
| abs9181 | GelRed核酸染料 | 1ml/1ml*5 |
二、检测蛋白和蛋白体外相互作用
体外检测的优点：
· 可直接证实蛋白一对一直接结合，排除第三方蛋白干扰
· 反应体系可控，可自由调整蛋白序列和反应环境
· 能精准测定结合亲和力、动力学、热力学参数
· 背景干扰少，实验重复性高
体外检测的缺点：
· 脱离细胞生理环境，缺失天然翻译后修饰与辅助因子
· 无法体现胞内空间定位、动态调控真实状态
1、GST-Pull Down
技术原理：
诱导表达纯化GST 标签融合蛋白，固定在谷胱甘肽琼脂糖珠上，上样另一个纯化后的His标签蛋白，洗脱后WB验证蛋白结合
为什么谷胱甘肽琼脂糖珠可以结合GST标签蛋白？
GST标签是谷胱甘肽S-转移酶，可以特异性识别和结合谷胱甘肽；谷胱甘肽琼脂糖珠表面共价偶联了谷胱甘肽配体，可以特异性的捕获GST标签蛋白；
简要步骤：
· 诱导表达纯化 GST蛋白
· 固定至谷胱甘肽琼脂糖珠
· 加入His标签蛋白体外孵育结合
· 洗涤洗脱，WB 检测结合情况
核心试剂：
GST标签琼脂糖珠（Cytiva品牌：17075601）
His标签琼脂糖珠（Cytiva品牌：17531806）
GST pull down试剂盒（Absin品牌：abs50082）
为什么选这个技术？
直接证实体外直接结合，排除细胞内其他蛋白干扰；
技术方案成熟；
文献通用；
不需要复杂仪器；
有什么局限性？
无法体现生理状态下的互作；
弱互作难检出；
只能定性不能定量，无法检测亲和力和动力学；
GST标签较大，可能会影响蛋白构象或蛋白结合；
部分相关产品
| 货号 | 名称 | 规格 |
| 17075601 | GLUTATHIONE SEPHAROSE 4B 10 ML | 10ml |
| 17531806 | NI SEPHAROSE 6 FF 5 ML | 5ml |
| abs50082 | GST Pull Down Kit | 6T |
| S0B1838 | His tag Recombinant Rabbit mAb (S-1398-151) | 25ul/100ul |
| S0B0271 | S-RMab® GST Tag Recombinant Rabbit mAb (S-372-19) | 25ul/100ul |
2、表面等离子体共振 SPR
技术原理：
利用表面等离子共振现象检测分子互作，芯片上两个分子结合和解离时会改变SPR角度，仪器实时记录并显示响应值信号变化；
什么是表面等离子共振现象？什么是SPR角？Biacore怎样利用SPR检测蛋白互作？
Biacore芯片表面有一层玻璃，玻璃上有一层50nm的金膜；当一束偏振光打到芯片上时，会在玻璃-金界面发生全反射；当全反射产生倏逝波和金表面等离子体波波数相同时，会发生共振，此时反射光强度急剧下降；
在固定波长下，反射光强度降到最低时的入射角，叫做SPR角。芯片上两个分子结合和解离的过程，会改变芯片的表面质量，造成表面折射率改变，进而引起SPR角度变化。
Biacore仪器实时记录SPR角度的变化，并换算成响应值RU实时显示在屏幕上，1 RU ≈ 1 pg/mm² 质量变化；两个分子结合时，RU值随着时间上升；两个分子解离时，RU值随着时间下降；检测结束后，软件会自动计算结合亲和力，结合动力学，结合浓度等参数；
简要步骤：
· 偶联一种蛋白至传感芯片；
· 流动相依次加入梯度浓度另一蛋白，每一个梯度中间进行再生步骤；
· 实时采集结合 / 解离曲线；
· 拟合计算动力学与亲和力常数 KD；
核心试剂：
CM5传感芯片（Cytiva品牌：BR100530）
氨基偶联试剂盒（Cytiva品牌：BR100050）
纯化目的蛋白（Cytiva品牌纯化产品或者优爱品牌重组蛋白产品）
为什么选这个技术？
直接证实体外直接结合，排除细胞内其他蛋白干扰；
精准测定结合动力学、亲和力 KD；
实时全程检测互作过程；
无需标记，避免标记影响；
超高灵敏度检测；
互作检测金标准，数据受审稿人认可；
有什么局限性？
需要有Biacore仪器；
或者找Biacore外包服务公司（优爱品牌可提供）；
部分相关产品
| 货号 | 名称 | 规格 |
| BR100530 | Series S Sensor Chip CM5 | 3片装 |
| BR100050 | Amine Coupling Kit | 1 Kit |
| 28995056 | His Capture Kit | 1 Kit |
| BR100349 | Acetate 4.0 | 50ml |
| BR100350 | Acetate 4.5 | 50ml |
| BR100351 | Acetate 5.0 | 50ml |
| BR100352 | Acetate 5.5 | 50ml |
| BR100354 | Glycine 1.5 | 100ml |
| BR100355 | Glycine 2.0 | 100ml |
| BR100356 | Glycine 2.5 | 100ml |
| BR100357 | Glycine 3.0 | 100ml |
| BR100669 | HBS-EP+ 10X | 1000ml |
| 28995084 | PBS-P+ 10X | 1000ml |
3、生物层干涉技术 BLI
技术原理：
利用生物层干涉技术检测分子互作，传感器表面两个分子结合和解离时改变光谱位置，仪器实时记录并显示光谱位移变化；
什么是生物层干涉技术？怎样检测蛋白互作？
传感器表面有光纤探头，尖端有光学参考层+生物分子层两个反射面，当有白光射入光纤，会在两个界面分别反射，形成干涉光谱。
当探头表面有两个蛋白发生结合和解离时，传感器表面生物膜厚度和密度改变，从而反射光光程差改变，使干涉光谱波长发生位移。
仪器实时记录波长位移，转化为结合和解离曲线并实时显示在屏幕上，两个分子结合时，信号随着时间上升；两个分子解离时，信号随着时间下降；检测结束后，软件会自动计算结合亲和力，结合动力学，结合浓度等参数；
简要步骤：
· 固定一种蛋白至传感器探头；
· 依次浸入梯度浓度另一蛋白，每一个梯度中间进行再生处理；
· 实时采集结合 / 解离曲线；
· 拟合计算动力学与亲和力常数 KD；
核心试剂：
生物传感器；
纯化的目的蛋白（Cytiva品牌纯化产品或者优爱品牌重组蛋白产品）
为什么选这个技术？
直接证实体外直接结合，排除细胞内其他蛋白干扰；
精准测定结合动力学、亲和力 KD；
实时全程检测互作过程；
有什么局限性？
需要有BLI仪器；
灵敏度低于SPR；
配体固定量低于SPR；
部分相关产品
| 货号 | 名称 | 规格 |
| 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL | 1根 |
| 29148721 | Superdex 75 Increase 10/300 GL | 1根 |
| 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL | 1根 |
| 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | 1根 |
| 17524801 | HISTRAP HP 1 X 5 ML | 1 X 5 ML |
| 17525501 | HISTRAP FF 5 X 5 ML | 5 X 5 ML |
| 17371201 | Ni Sepharose excel 25 ml | 25 ml |
| 17531801 | NI SEPHAROSE 6FF, 25 ML | 25 ML |
| 17075601 | GLUTATHIONE SEPHAROSE 4B 10 ML | 10 ML |
蛋白-蛋白互作技术总结
| 技术 | Co-IP | 酵母双杂交 | PLA | BiFC | GST-Pull down | SPR | BLI |
| 体内&体外检测 | 体内（细胞内源） | 体内（外源构建，酵母胞内） | 体内（组织切片&细胞爬片） | 体内（外源构建） | 体外 | 体外 | 体外 |
| 是否可定量&定位检测 | 半定量，无定位 | 半定量，无定位 | 半定量 + 定位 | 半定量 + 定位 | 半定量，无定位 | 精准定量，无定位 | 精准定量，无定位 |
| 是否使用仪器 | 不需要 | 不需要 | 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | 不需要 | Biacore仪器 | BLI仪器 |
| 是否可视化 | 否 | 否 | 是 | 是 | 否 | 否 | 否 |
| 是否能检测亲和力&动力学 | 不能 | 不能 | 不能 | 不能 | 不能 | 可检测 | 可检测 |
| 是否能实时检测 | 否 | 否 | 否 | 否 | 否 | 是 | 是 |
| 蛋白是否有标签 | 可不带有标签 | 需带有标签 | 无需标签 | 需带有标签 | 需带有标签 | 可不带有标签 | 可不带有标签 |
