细胞计数仪在单细胞测序中进行准确计数和样品质量验证的应用优势
利用细胞计数仪在单细胞测序中评估细胞
概述单细胞测序技术能够用来表征异常细胞群，分析稀有细胞和细胞图谱网络，发现异质性等。由于单细胞测序巨大的应用潜力，目前此技术正在经历爆炸性增长。然而，单细胞测序需要成本和时间的大量投资。为了确保时间和资源的投资得到高质量的数据回报，处理前的样本质量至关重要。此外，由于所有的单细胞测序方案都依赖于在处理前准确定量细胞，因此准确的细胞计数是非常重要的第一步。
因此，用于定量单细胞测序样品的自动细胞计数仪必须准确可靠地对所有样品类型的细胞进行计数，包括分离的组织、分离的细胞核、全血和培养的细胞系。在此，我们演示了LUNA-FX7自动细胞计数仪如何为不同类型的样品提供准确的计数和样品质量的验证。
单细胞测序工作流程：1) 组织收集，2) 分离细胞制备，3) 测序文库制备，4) 测序和 5) 分析。
细胞样本质量评估
最初收集了两个细胞样本用于单细胞测序分析。两个样本均使用标准细胞活力方案和AO/PI细胞染色染料进行计数。第一个样品是从人外周血中分离出的B细胞，具有高度的活力和单细胞分离度，适合下游文库制备。
B细胞为单细胞文库做好了充分准备，包括所有阳性绿色细胞，没有死细胞（RF）或颗粒碎片(BF)，具有100%活力。这些健康细胞的平均大小为10.7 μm，在细胞计数时浓度为3.00E+05个细胞/ml的细胞簇图中的单细胞分离率为100%。
相比之下，第二个样品（贴壁AsPC-1细胞）提供了一个示例，说明基于图像的准确计数器对于评估样品制备的数量和质量至关重要。收获后，AsPC-1细胞发生不完全解离。生成的图像清楚地显示，很大一部分细胞内容物仍被纳入结合的簇中，高达9%，而AsPC-1的活力仅为56%。根据活力和细胞分离情况，该样品不适合下游处理。在许多情况下，单细胞的样品细胞是有限的，需要低细胞浓度和重复计数才能获得最佳和快速的细胞计数。在低细胞浓度的精确计数中，我们使用LUNA 1通道载玻片，它可以容纳更大的细胞体积，即使细胞浓度低至1.00E+04个细胞/ml也可以进行计数。
用于单细胞测序的细胞样品制备不充分的示例。“失败的“AsPC-1细胞制备显示死细胞含量高且含有不完全解离的细胞簇。LUNA-FX7的簇直方图功能可以准确评估细胞簇百分比与分离细胞的百分比。
分析完整的细胞核
对于一些单细胞测序应用，分离的细胞需要进一步处理以产生分离且完整的细胞核。接下来我们评估了LUNA-FX7的实用性，以评估完全分离的细胞核的整体质量和数量。为此，我们使用了3种细胞系-HL60、HeLa细胞和HEK细胞。下图显示了包含完整健康HL60细胞（左）、细胞核部分分离的HL60细胞（中）和细胞核完全分离（右）的3幅图像，并且具有完整细胞膜的活细胞通过AO染色后呈现绿色荧光。相比之下，死细胞和分离的细胞核都因通过缺损或缺失的细胞膜吸收PI而呈现红色荧光。然而，LUNA-FX7允许您使用大小信息区分完整的死细胞和完整的细胞核。例如，完整活体的HL-60的平均细胞大小为13.4微米，完全分离的细胞核的平均大小为8.3微米，表明细胞膜和血浆部分被成功去除。未完全分离的核尺寸经测量平均为10.2 μm，表明分离核的质量不足以进行下游处理。
HL 60细胞的细胞核分离过程的可能结果。明场(BF)图像和带标签的叠加荧光图像可让您轻松区分不同的细胞“状态”。在BF图像中，完整的细胞明显比分离的细胞核更突出、更暗。同时，荧光图像和计数可以实现准确的定量评估。
此外，LUNA-FX7的高分辨率明场图像可用于目视验证分离核的质量。例如，分离的细胞核可以很容易地与完整细胞区分开来，因为细胞核的边界更薄，并且由于缺乏细胞膜而不明显。
区分活核、死核和完整核。由于死细胞和完整的细胞核都缺乏完整的细胞膜，因此从碘化丙啶染色中可以看到红色荧光。LUNA-FX7生成的BF图像和尺寸测量可以常规地区分死细胞和完整的分离细胞核。
总之，LUNA-FX7在三通道成像（BF、GF和RF）方面的功能和灵敏度，以及复杂的标记算法，使您可以在进行昂贵的下游处理之前建立样品通过与否的质量控制标准。
评估分离的核和可能的结果。明场(BF)图像和叠加荧光图像可让您轻松区分不同的细胞“状态”。在BF 图像中，完整的细胞比孤立的细胞核显得明显更突出、边界更暗。同时，荧光图像和计数可以实现准确的定量评估。活的完整细胞用吖啶橙(GF)染色，分离的细胞核被染成红色。LUNA-FX7可以准确区分细胞质大、细胞核小(HeLa)的样品以及细胞核相对于细胞质较大的细胞类型(HEK293)。
结论
对于单细胞测序，LUNA-FX7为探索提高细胞样本准确性和可靠性的研究人员提供了见解，以评估各种样本类型中的细胞和分离的细胞核样本的数量和质量。
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