icIEF-native MS联用技术在cys-ADC电荷异质性分析中重要应用
摘要
本文中展示了2024年9月中检院单抗室最新发表在Electrophoresis 和 Journal of Chromatography A期刊上的两篇文章[1-2]，分别对多个半胱氨酸偶联的抗体-药物偶联物（cysteine-conjugated antibody-drug conjugate, cys-ADC）进行表征，尤其是电荷异质性分析的研究结果。
前言
这两篇文章均以cys-ADC作为研究对象。该类产品是通过一个可裂解的连接子将具有细胞毒性的药物偶联至单克隆抗体上，通过单克隆抗体精准识别靶细胞（通常为癌细胞）后，整个ADC分子被内吞进细胞，随后连接子在胞内裂解，释放出细胞毒性药物，从而实现精准杀灭靶细胞的目的，同时最大程度上减小高细胞毒性药物可能给病人带来的副作用。对于本文中所讨论的cys-ADC，在偶联过程中，单抗轻重链间的二硫键被部分还原，暴露出的自由巯基用于小分子药物偶联，轻重链间仅靠非共价力相互结合，故能够保持分子内非共价相互作用的非变性质谱（native MS）技术被广泛应用在cys-ADC的表征中。
工作亮点
这两篇文章的突出亮点在于成像等电聚焦毛细管电泳 (Imaged Capillary Isoelectric Focusing, icIEF)和非变性质谱技术联用对于揭示cys-ADC电荷异质性的重要性。
对于cys-ADC产品，其单抗包含多种翻译后修饰，如糖基化、脱酰胺和氧化等，再加上小分子药物的偶联，异质性极高，传统的液质联用技术对其电荷变异体的分离程度有限。而icIEF技术由于分离原理不同，可以从另一个角度对ADC进行最大程度上的电荷异质体分离，随后使用基于Orbitrap平台的高灵敏度非变性质谱技术对各个电荷异质峰进行在线完整蛋白分子量测定。
结果与讨论
研究人员首先使用NISTmAb标准品进行了icIEF native MS方法开发，工作流程如图1所示。Advanced Electrophoresis Solutions Ltd. （AES）公司的CEInfinite Automated Preparative icIEF System与Thermo Scientific™ Orbitrap™ Exploris™ 240 超高分辨质谱仪被用于icIEF native MS分析。该icIEF系统可同时实现分析型/直连型/离线馏分收集功能，与质谱直连非常灵活，不需要额外购买单独的离子源接口。AEstyle系列两性电解质可实现超高分辨率的电荷异质体分离，且对质谱的污染小。Orbitrap Exploris 240 超高分辨质谱仪的高灵敏度和高质量精度有助于发现并准确鉴定低丰度的组分，这一点对于非变性质谱条件下的完整分子量分析尤为关键，因为相较于变性质谱，非变性质谱条件下蛋白的带电量减少，质谱响应降低。
图1. icIEF native MS 整体工作流程
图2展示了使用 icIEF native MS流程对NISTmAb分析的icIEF-UV分离谱图、质谱总离子流（TIC）图和部分电荷异质峰的原始谱图及解卷积结果。如图2A所示，NISTmAb的电荷异质峰在icIEF层面上得到了分离，随之被直连的质谱检测到（图2B）。从图2C展示的主峰及部分酸/碱峰原始谱图不难发现，对于高丰度的主峰和低丰度的酸/碱峰，均可在非变性条件下获得高信噪比的原始谱图，数据的高质量毋庸置疑。图2D为图2C中原始数据的解卷积结果，可见各个电荷异质峰中的组分均可得到解析，同时兼具高质量精度（主峰中A2G0F+A2G1F， 实测值与理论值质量偏差仅为0.9ppm）。更多详细信息可参阅原文[1]。
图2A. icIEF native MS条件下NISTmAb的icIEF-UV分离谱图。
图2B. icIEF native MS条件下NISTmAb的icIEF-MS质谱总离子流(TIC)图。
图2C. icIEF native MS条件下NISTmAb的主峰/酸峰1/碱峰3一级质谱图。
图2D. icIEF native MS条件下NISTmAb的主峰/酸峰1/碱峰3解卷积谱图。
图3分别展示了使用 icIEF native MS流程对两个cys-ADC 维迪西妥[2]和维泊妥珠[1]进行电荷异质性分析的结果。在icIEF层面上，两个cys-ADC均得到了分离，随后的native MS直连结果表明，两个ADC电荷异质峰的分布略有差异，可能是由于两个ADC分子各自的理化性质不同所导致的，进一步证明了ADC分子的复杂性和对其进行深入表征的必要性。详细结果可参阅原文[1-2]。
本文所介绍的工作中，所使用的软件也值得关注：Thermo Scientific™ Chromeleon™ Chromatography Data System (CDS) Software 被用于icIEF和Orbitrap超高分辨质谱平台的仪器控制及数据采集[1]，为客户的日常实验提供了极大便利，同时也可以满足客户对于软件合规性的需求。
本文所介绍的工作中，所使用的软件也值得关注：Thermo Scientific™ Chromeleon™ Chromatography Data System (CDS) Software 被用于icIEF和Orbitrap超高分辨质谱平台的仪器控制及数据采集[1]，为客户的日常实验提供了极大便利，同时也可以满足客户对于软件合规性的需求。
图3A. icIEF native MS条件下维迪西妥的icIEF-UV分离图（左）和icIEF-MS质谱总离子流(TIC)图（右）。
图 3B. icIEF native MS条件下维迪西妥各个电荷异质峰的解卷积图。
图3C. icIEF native MS条件下维泊妥珠的icIEF-UV分离图（左）和icIEF-MS质谱总离子流(TIC)图（右）。
图 3D. icIEF native MS条件下维泊妥珠各个电荷异质峰的解卷积图。结论
本文所介绍的两篇文章强调了创新型 icIEF-native MS 技术在 cys-ADC电荷异质性分析中的重要贡献。该技术可被广泛应用于具有非共价相互作用分子的电荷异质性分析中，提供全面的完整分子量信息用于组分鉴定。对于有合规需求的客户，变色龙软件的使用可满足客户要求。
原文参考链接：
[1] https://doi.org/10.1002/elps.202400083
[2] https://doi.org/10.1016/j.chroma.2024.465353
原文参考链接：
[1] https://doi.org/10.1002/elps.202400083
[2] https://doi.org/10.1016/j.chroma.2024.465353
