过氧化氢酶试剂盒实验钼酸铵比色法测定详解
测定意义：
CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。
测定原理：
过氧化氢能氧化MoO42-成MoO52-,MoO52-接受氢氧根的电子成键，分子间立即脱水缩合，得到稳定的黄色复合物(H2MoO4·XH2O)n在405nm处有强烈吸收峰，其吸光值和过氧化氢浓度成线性关系。测定出体系剩余过氧化氢在405nm的吸光值即可反映CAT的催化活性。
粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
酶标仪预热30min以上，调节波长至405 nm。2、在EP管中加入下列试剂
CAT活性计算：
1、标准曲线：y = 0.09x + 0.0013 R2 = 1
x：体系中过氧化氢浓度变化值（μmol/mL）
y：吸光值差值ΔA
2、血清（浆）CAT活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(μmol /min/mL)= =(ΔA-0.0013)÷0.09×V反总÷V样÷T=444.44×(ΔA-0.0013)
3、组织、细菌或细胞中CAT活力计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=444.44×(ΔA-0.0013)÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(μmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V÷（W× V样÷V样总）÷T=444.44×(ΔA-0.0013)÷W
V反总：反应体系总体积，0.8 mL；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项：
1、预实验若发现酶活性过高（A测定＜0.1），可用提取液适当稀释样品后测定，并在计算公式中乘以相应稀释倍数。
2、若A空白＜A测定，一方面可能是酶活性过低，可将反应时间2延长到5min,另一方面可能样本中杂质干扰严重，可将样本稀释5倍左右后测定，并在计算公式中代入实际反应时间和乘以相应稀释倍数。
CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。
测定原理：
过氧化氢能氧化MoO42-成MoO52-,MoO52-接受氢氧根的电子成键，分子间立即脱水缩合，得到稳定的黄色复合物(H2MoO4·XH2O)n在405nm处有强烈吸收峰，其吸光值和过氧化氢浓度成线性关系。测定出体系剩余过氧化氢在405nm的吸光值即可反映CAT的催化活性。
粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
酶标仪预热30min以上，调节波长至405 nm。2、在EP管中加入下列试剂
| 试剂名称（μL） | 测定管 | 空白管 |
| 样本 | 10 | |
| 试剂一 | 60 | |
| 混匀，25℃准确反应2 min | ||
| 试剂二 | 200 | |
| 试剂三 | 530 | 530 |
| 试剂二 | 200 | |
| 提取液 | 10 | |
| 试剂一 | 60 | |
| 混匀，取200μL于96孔板立即测定A空白和A测定，ΔA=A空白-A测定。空白管只需做一管。 | ||
CAT活性计算：
1、标准曲线：y = 0.09x + 0.0013 R2 = 1
x：体系中过氧化氢浓度变化值（μmol/mL）
y：吸光值差值ΔA
2、血清（浆）CAT活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(μmol /min/mL)= =(ΔA-0.0013)÷0.09×V反总÷V样÷T=444.44×(ΔA-0.0013)
3、组织、细菌或细胞中CAT活力计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=444.44×(ΔA-0.0013)÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(μmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V÷（W× V样÷V样总）÷T=444.44×(ΔA-0.0013)÷W
V反总：反应体系总体积，0.8 mL；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项：
1、预实验若发现酶活性过高（A测定＜0.1），可用提取液适当稀释样品后测定，并在计算公式中乘以相应稀释倍数。
2、若A空白＜A测定，一方面可能是酶活性过低，可将反应时间2延长到5min,另一方面可能样本中杂质干扰严重，可将样本稀释5倍左右后测定，并在计算公式中代入实际反应时间和乘以相应稀释倍数。
