优化PCR反应要素配置事项详细介绍

PCR反应，全称聚合酶链式反应，是一种分子生物学技术，能在短时间内将特定的DNA序列大量复制。这次实验我们针对某一特定的基因片段进行了PCR扩增，现在，让我们揭晓反应结果。在试管中，我们可以看到明显的DNA条带，这表示PCR反应成功，我们成功扩增了目标DNA序列。这个结果对于我们的研究具有重要意义，它不仅证明了我们的实验方法的有效性，也为我们后续的研究提供了重要的参考。一个PCR反应过程分为很多的步骤，包括样本采集，运输，核酸提取，qpcr扩增等步骤，因此优化PCR反应要素配置及其重要，下面详细介绍：
 

1、引物及浓度：

①长度：15～30bp。
②碱基：G+C含量以40%～60%为宜，ATGC最好随机分布，避免5个以上的碱基成串排列。③避免引物内部出现二级结构、两条引物间互补，特别是3′端的互补。
④引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对。
⑤与其它序列无明显同源性。⑥浓度为0.1～1μmol或10～100pmol。

2、酶及其浓度：

催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100μl时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

3、dNTP的质量与浓度：

dNTP应为50～200μmol/L，4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），过高dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

4、模板：

模板的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，避免DNA纯化中的SDS和蛋白酶K等杂质。

5、Mg2+浓度：

一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

6、温度与时间：

①变性：93℃～94lmin℃，过高或过低的温度影响酶的活性。②退火：取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。一般高于Tm值5℃～10℃，时间为30～60s。③延伸：常用温度为72℃，时间根据待扩增片段的长度而定。

7、循环次数：

主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。