细胞与基因治疗：如何保证细胞计数准确高效？

你是否在为计数尺寸较小的PBMC、T细胞等而发愁？
在筛选用于输血的红细胞时，为避免免疫反应，对不同细胞类型进行区分尤为重要，而台盼蓝无法区分，这一问题该如何解决？
本文提供了使用荧光染料、借助高通量荧光细胞计数仪快速准确对细胞计数、鉴别的方式。

吖啶橙（AO）等荧光染料可以更准确地计数血液样本中的白细胞，这是一项有助于对抗血癌的创新方法。
血癌——包括淋巴瘤、白血病和骨髓瘤，通常难以治疗。传统的化疗和放疗疗效有限，特别是在复发或对治疗有抵抗的情况下容易引起严重的副作用。
最近出现的新疗法，特别是嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，有希望解决这些复杂的疾病。CAR-T细胞疗法包括提取患者自身的免疫T细胞，对它们进行基因工程改造靶向癌细胞，然后将它们重新引入患者体内。
这种方法在治疗血癌方面取得了显著的成功。然而，要使CAR-T细胞疗法充分发挥其潜力，临床医生需要了解每个样品中免疫细胞的准确数量和质量。
 
自动计数
位于韩国首尔的一家名为NanoEntek的公司于2000年代初期开始研究可行的解决方案。该公司的研究人员探索了微流控技术对改善血液样本细胞计数的潜力。
传统方法使用台盼蓝染料，该染料仅染色死细胞。病理学家通过手动计算细胞总数，然后减去染色死细胞的数量来确定细胞活力。
然而，这种方法是费时费力的。NanoEnTek意识到需要更好的解决方案，于是开发了使用自动化细胞计数的方法。通过引入自动细胞计数仪，该公司使该过程更加一致、准确，并操作简便。此外，通过使用自动化高通量细胞计数仪，显著提高了细胞计数的效率。
 

细胞鉴别
随着技术的进步，传统方法的可靠性越来越低。这体现在进行细胞治疗研究时，原代细胞、外周血单核细胞 （PBMC） 和干细胞等多种细胞类型的计数不准确。
例如，台盼蓝的显著局限性是它无法区分红细胞和PBMC。在筛选用于输血的红细胞时，对不同细胞类型进行区分尤为重要，因为白细胞的存在可能会引起受者的免疫反应。
荧光染料如AO和DAPI通过选择性染色细胞核来克服这一限制。因此，这可以帮助研究人员和临床医生轻松区分具有细胞核的白细胞和缺乏细胞核的红细胞。
此外，手动计数难以对体积小的血细胞进行准确计数。荧光染料可以克服这个问题，因为它们选择性地对细胞核进行染色，并在显微镜下观察时发出强烈的荧光。因此，它们甚至可以更精准地测量最小的细胞，如PBMC、T细胞和自然杀伤细胞，这些细胞对细胞治疗至关重要。
此外，NanoEnTek的多帧成像技术可以进一步提高测量精度。“自动成像系统可以对每个样本都采集到多张图像，”NanoEnTek的Chan Park解释道，“由于所有测量值都是平均的，因此精度得到了显著提高。”
 
解决复杂问题
在处理含有污染物的样品或可能患有污染物的患者的样品时，基于荧光的方法非常有效。
准确的细胞计数对细胞和基因治疗至关重要，正在使用NanoEnTek的荧光细胞计数仪的公司InnoBation Bio的 Beom Choi 说：“准确的活淋巴细胞数量是材料质控的一个简单而重要的标准，”他解释道，“如果初始密度测量不正确，一切都会分崩离析。”
免疫系统被激活而导致炎症是传统方法的挑战。这可能导致淋巴细胞样本被大量红细胞污染，传统方法可能会错误地将其计为淋巴细胞。“然而，由于红细胞缺乏细胞核，它们不会吸收荧光染料，”Choi解释说，“这使我们能够准确地确定起始材料中活细胞的数量。”
冷冻是病理学实验室的常见做法，同样面临着挑战。
使用传统的细胞计数方法时，台盼蓝会低估解冻后的死细胞数量。
美国德克萨斯州休斯顿卫理公会研究所的生物医学工程教授Moonsoo Jin目前正在评估NanoEnTek的一种免疫表型分析仪器。他热衷于基于荧光的方法提高精度的能力，特别是在经历多次冻融循环的细胞治疗产品中。
“基于荧光的自动化细胞计数技术满足了对细胞准确且快速地计数，并能获得细胞治疗中需要的细胞活力的相关数据，通常需要在制造和产品发布过程中多次冻融”，Jin指出，“NanoEnTek的仪器只需要少量样品，就可以提供准确和快速的细胞数量和活力结果。”
这种准确性、高效率和小样本量的结合凸显了基于荧光的细胞计数技术在细胞治疗中的显著优势。
 

展望
NanoEnTek扩展了这种基于荧光的技术，不仅旨在区分活细胞和死细胞，还要区分各种类型的免疫细胞。这一进展与用于治疗血癌的CAR-T细胞疗法（同时使用T细胞和自然杀伤细胞）相关。正如Park所指出的，其目标是扩展细胞计数仪的功能，以涵盖免疫表型分析，以适应基于细胞疗法不断变化的需求。
基于这些创新，NanoEnTek开发了能够同时处理多达 48 个样品的自动化的高通量细胞计数仪——EVE™ HT FL高通量荧光自动细胞计数仪。此外，与传统方法相比，它需要的样本量要少得多。这对于CAR-T细胞疗法等研究尤其有利，因为CAR-T细胞疗法只有少量可用于各种评估。“NanoEnTek将自动化系统的速度和准确性与荧光染料的特异性结合在一个设备中，”Park说，“这有望改善细胞分析，为提高生物医学研究和治疗的精度铺平道路。”
“随着细胞治疗和基因治疗的不断扩展，从血癌扩展到实体瘤，基于荧光的细胞染色方法的应用进一步蓬勃发展，有望在更广泛的治疗环境中发挥作用。