免疫荧光(IF)实验样本要求与实验操作步骤介绍
免疫荧光(immunofluorescence，IF)，通常是指用荧光标记的抗体示踪或检查样品中相应抗原的方法。根据抗原抗体反应，将不影响抗原抗体相互作用的荧光分子标记在抗体上，与其相应的抗原反应后，在荧光显微镜下针对荧光标记分子的激发光发射光进行观察，从而检测目的指标的相对含量、在组织细胞中的定位。
样本准备要求：
1、取材手法：要求取材器械锋利，尽可能选择薄的手术刀片，减少剪刀的使用，避免挤压挫伤标本。较准确地取到目的部位组织，夹取标本的时候尽量远离目的区域组织。
2、取材速度：尽量保证样本离体后5min内放入到合适的固定液内。如果一只动物同时取多种器官，优先取消化器官，其次取中枢神经系统器官(脑，脊髓等)，皮肤、肌肉等可放到最后取。
3、组织块大小：未经灌注的标本组织厚度不要超过1cm。
4、固定液：针对不同的标本特点及实验目的一定要选用正确的固定液。
5、固定液量：固定液体积为组织的10倍，且组织能在容器内自由移动，不贴壁不沉底，并做好清晰标记。
6、固定温度：常温即可，无需冷藏，切勿冷冻结冰，否则固定液结冰形成冰晶严重破坏组织形态结构。
样本准备要求：
1、取材手法：要求取材器械锋利，尽可能选择薄的手术刀片，减少剪刀的使用，避免挤压挫伤标本。较准确地取到目的部位组织，夹取标本的时候尽量远离目的区域组织。
2、取材速度：尽量保证样本离体后5min内放入到合适的固定液内。如果一只动物同时取多种器官，优先取消化器官，其次取中枢神经系统器官(脑，脊髓等)，皮肤、肌肉等可放到最后取。
3、组织块大小：未经灌注的标本组织厚度不要超过1cm。
4、固定液：针对不同的标本特点及实验目的一定要选用正确的固定液。
5、固定液量：固定液体积为组织的10倍，且组织能在容器内自由移动，不贴壁不沉底，并做好清晰标记。
6、固定温度：常温即可，无需冷藏，切勿冷冻结冰，否则固定液结冰形成冰晶严重破坏组织形态结构。
实验流程图
操作步骤：
1、细胞准备：对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2、固定：根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min.
3、通透：使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.
4、封闭：使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.
5、一抗结合：室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min.
6、二抗结合：间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
7、封片及检测：滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
