用于癌症给药的细胞/组织重组脂质纳米颗粒(rLNPs)的制备方法及潜力
介绍：
纳米药物是设计更好的药物递送系统（DDS）的一种有前景的方法，而基于细胞/组织的脂质载体的开发是一种有前景的策略。在本研究中，作者提出了重组脂质纳米颗粒（rLNPs）的概念，并提供了一种简单的制备方法。结果表明，从细胞（小鼠乳腺癌症细胞系，4T1）和组织（小鼠肝组织）中制备超小（~20nm）rLNP高度可再生。作为一个选定的模型平台，来源于小鼠肝组织的rLNP可以进一步用成像分子（吲哚菁绿和香豆素6）标记，并用靶向配体（生物素）修饰。此外，rLNPs被证明具有高度的生物相容性，能够负载各种药物，如盐酸阿霉素（Dox）和姜黄素（Cur）。最重要的是，Dox负载的rLNPs（rLNP/Dox）在体外和体内都表现出良好的抗癌性能。因此，rLNPs可能是构建不同DDS和治疗多种疾病的潜在多功能载体。
制备：
材料：
盐酸阿霉素Dox、姜黄素（Cur）、香豆素（C6）、吲哚菁绿（IGG）、甲基噻唑四氮唑（MTT）。DSPE-PEG2000-Biotin（艾伟拓（上海）医药科技有限公司），其他没有具体说明的化学品和试剂都是从阿拉丁购买，并且是分析级的。
艾伟拓AVT在售的DSPE-PEG2000-Biotin来自日本丘比的蛋黄卵磷脂，并且是以蛋黄粉为原料通过先进工艺提取、纯化的磷脂混合物。
选择好的磷脂产品可以来艾伟拓（上海）医药科技有限公司看一看，这是一家专营磷脂类高端药用辅料的科技公司，公司旗下产品丰富，有着技术专家的专业支持，能够及时的解决客户问题，助力客户价值的提升。
rLNPs的制备：
遵循先前报道的方案，从细胞和组织中提取全脂，并进行修饰。简而言之，将100 mg的新鲜组织（或5x107的细胞）切成片，装入500 µL 含有75%甲醇的玻璃均质器中。在0℃下研磨约50次后，将混合物转移到含有另1 mL甲基叔丁基醚（MTBE）的棕色试管中，将试管放入摇床中1小时，以便充分提取脂质，然后，向管中加入250 µL纯水，静置10min进行相分离，然后在0℃下，15000xg离心15min，将含有浓缩脂质的上部MTBE相转移到另一个新的棕色试管中，并使用吹氮仪器进行干燥。
将得到的脂质溶解在乙醇中，达到指定的浓度。然后，根据文献作者之前的研究，采用溶剂扩散法，将乙醇溶液在搅拌（500rpm），以0.1 mL/s的恒定速率，通过注射器注入纯水（体积比为：1：9）。
关于材料和方法的所有详细信息请参考support information。
结果：
图1：使用从4T1细胞和小鼠肝组织提取的脂质制备的rLNP的尺寸分布（A，B）和形态观察（C，D）。比例尺：200 nm。
图2：4T1细胞中，未修饰（上）和生物素修饰（下）的C6标记rLNP的时间依赖性细胞摄取谱。比例尺：50μm
图3：rLNPs的生物相容性测定。（A）用不同浓度的rLNP处理1小时后2%红细胞的溶血。插入的图像显示不同组的上清液。（B）小鼠的体重变化每隔一天静脉注射rLNPs（100mg/kg），持续14天。数据显示为三个独立结果的平均值和标准差。（C）从给药结束时从受体获得的主要器官制备的HE组织病理学切片。比例尺：100μm。
图4：rLNPs的体内肿瘤积聚测定。将游离ICG（左）和ICG标记的rLNP（右）静脉注射到原位4T1荷瘤小鼠中，并通过实时成像观察受试者在6（A）、24（B）和48小时（C）时的ICG信号分布。在注射后48小时，切除一名受试者的主要器官和肿瘤组织进行离体成像（D）。（E） 静脉内给予游离Dox和rLNP/Dox（Dox剂量：5mg/kg）后4T1荷瘤小鼠的时间依赖性组织/血浆Dox浓度。Dox浓度分别表示为组织的μg/g组织和血浆的μg/mL。数据显示为三个独立结果的平均值和标准差*P<0.05
图6：rLNP/Dox的体外抗癌性能。（A） 孵育24小时后，游离Dox和rLNP/Dox对4T1细胞的浓度依赖性细胞毒性。数据显示为三个独立结果的平均值和标准差。（B） MCTS与游离Dox或rLNP/Dox（Dox浓度：1μg/mL）孵育4天后的图像。比例尺：500μm。左侧的定量结果表示MCTS的相应体积
图7：rLNP/Dox的体内抗癌性能。（A） 肿瘤体积变化和（B）HE和Ki67染色后的离体肿瘤切片的代表性图像。比例尺：100μm*P＜0.05。
结论：
总之，在本研究中，作者提出了rLNPs的概念和制备方法，并展示了其作为多功能药物递送载体的潜力。它们的优点包括：（1）从细胞和组织制备的重复性高；（2） 用荧光分子进行柔性标记，并对靶向配体和可能的其他功能部分进行修饰；（3） 高生物相容性；（4） 能够装载各种分子/药物；以及（5）作为药物载体具有良好的体外和体内抗癌性能，这可以通过负载其他种类的药物进一步扩展到治疗其他疾病。在未来的工作中，作者将重点关注以下几个方面：（1）将rLNPs的应用扩展到不同的药物和其他疾病模型；（2） 探讨rLNPs是否具有细胞/组织特异性功能；和（3）阐明是否可以使用rLNP实现细胞/组织训练，因为它们包含母体细胞/组织的脂质组学。
纳米药物是设计更好的药物递送系统（DDS）的一种有前景的方法，而基于细胞/组织的脂质载体的开发是一种有前景的策略。在本研究中，作者提出了重组脂质纳米颗粒（rLNPs）的概念，并提供了一种简单的制备方法。结果表明，从细胞（小鼠乳腺癌症细胞系，4T1）和组织（小鼠肝组织）中制备超小（~20nm）rLNP高度可再生。作为一个选定的模型平台，来源于小鼠肝组织的rLNP可以进一步用成像分子（吲哚菁绿和香豆素6）标记，并用靶向配体（生物素）修饰。此外，rLNPs被证明具有高度的生物相容性，能够负载各种药物，如盐酸阿霉素（Dox）和姜黄素（Cur）。最重要的是，Dox负载的rLNPs（rLNP/Dox）在体外和体内都表现出良好的抗癌性能。因此，rLNPs可能是构建不同DDS和治疗多种疾病的潜在多功能载体。
制备：
材料：
盐酸阿霉素Dox、姜黄素（Cur）、香豆素（C6）、吲哚菁绿（IGG）、甲基噻唑四氮唑（MTT）。DSPE-PEG2000-Biotin（艾伟拓（上海）医药科技有限公司），其他没有具体说明的化学品和试剂都是从阿拉丁购买，并且是分析级的。
艾伟拓AVT在售的DSPE-PEG2000-Biotin来自日本丘比的蛋黄卵磷脂，并且是以蛋黄粉为原料通过先进工艺提取、纯化的磷脂混合物。
选择好的磷脂产品可以来艾伟拓（上海）医药科技有限公司看一看，这是一家专营磷脂类高端药用辅料的科技公司，公司旗下产品丰富，有着技术专家的专业支持，能够及时的解决客户问题，助力客户价值的提升。
rLNPs的制备：
遵循先前报道的方案，从细胞和组织中提取全脂，并进行修饰。简而言之，将100 mg的新鲜组织（或5x107的细胞）切成片，装入500 µL 含有75%甲醇的玻璃均质器中。在0℃下研磨约50次后，将混合物转移到含有另1 mL甲基叔丁基醚（MTBE）的棕色试管中，将试管放入摇床中1小时，以便充分提取脂质，然后，向管中加入250 µL纯水，静置10min进行相分离，然后在0℃下，15000xg离心15min，将含有浓缩脂质的上部MTBE相转移到另一个新的棕色试管中，并使用吹氮仪器进行干燥。
将得到的脂质溶解在乙醇中，达到指定的浓度。然后，根据文献作者之前的研究，采用溶剂扩散法，将乙醇溶液在搅拌（500rpm），以0.1 mL/s的恒定速率，通过注射器注入纯水（体积比为：1：9）。
关于材料和方法的所有详细信息请参考support information。
结果：
图1：使用从4T1细胞和小鼠肝组织提取的脂质制备的rLNP的尺寸分布（A，B）和形态观察（C，D）。比例尺：200 nm。图2：4T1细胞中，未修饰（上）和生物素修饰（下）的C6标记rLNP的时间依赖性细胞摄取谱。比例尺：50μm图3：rLNPs的生物相容性测定。（A）用不同浓度的rLNP处理1小时后2%红细胞的溶血。插入的图像显示不同组的上清液。（B）小鼠的体重变化每隔一天静脉注射rLNPs（100mg/kg），持续14天。数据显示为三个独立结果的平均值和标准差。（C）从给药结束时从受体获得的主要器官制备的HE组织病理学切片。比例尺：100μm。图4：rLNPs的体内肿瘤积聚测定。将游离ICG（左）和ICG标记的rLNP（右）静脉注射到原位4T1荷瘤小鼠中，并通过实时成像观察受试者在6（A）、24（B）和48小时（C）时的ICG信号分布。在注射后48小时，切除一名受试者的主要器官和肿瘤组织进行离体成像（D）。（E） 静脉内给予游离Dox和rLNP/Dox（Dox剂量：5mg/kg）后4T1荷瘤小鼠的时间依赖性组织/血浆Dox浓度。Dox浓度分别表示为组织的μg/g组织和血浆的μg/mL。数据显示为三个独立结果的平均值和标准差*P<0.05图6：rLNP/Dox的体外抗癌性能。（A） 孵育24小时后，游离Dox和rLNP/Dox对4T1细胞的浓度依赖性细胞毒性。数据显示为三个独立结果的平均值和标准差。（B） MCTS与游离Dox或rLNP/Dox（Dox浓度：1μg/mL）孵育4天后的图像。比例尺：500μm。左侧的定量结果表示MCTS的相应体积图7：rLNP/Dox的体内抗癌性能。（A） 肿瘤体积变化和（B）HE和Ki67染色后的离体肿瘤切片的代表性图像。比例尺：100μm*P＜0.05。结论：
总之，在本研究中，作者提出了rLNPs的概念和制备方法，并展示了其作为多功能药物递送载体的潜力。它们的优点包括：（1）从细胞和组织制备的重复性高；（2） 用荧光分子进行柔性标记，并对靶向配体和可能的其他功能部分进行修饰；（3） 高生物相容性；（4） 能够装载各种分子/药物；以及（5）作为药物载体具有良好的体外和体内抗癌性能，这可以通过负载其他种类的药物进一步扩展到治疗其他疾病。在未来的工作中，作者将重点关注以下几个方面：（1）将rLNPs的应用扩展到不同的药物和其他疾病模型；（2） 探讨rLNPs是否具有细胞/组织特异性功能；和（3）阐明是否可以使用rLNP实现细胞/组织训练，因为它们包含母体细胞/组织的脂质组学。
