类器官作为肠道研究最佳模型的原因及优势分析

长期以来，肠道上皮细胞（IECs）被认为是代谢和免疫形态的重要调节因子，但是肠道的体外研究一直存在困难。目前尚缺乏理想的肠上皮体外研究模型。细胞系及原代细胞/组织的培养均无法反映肠道的多样性和复杂性,两种方法均有诸多缺陷。
 

多数细胞系仅限于培养一种肠上皮细胞亚型，且为了能够长期培养常常会引入基因修饰。由于原代培养的肠上皮细胞在体外会迅速开始凋亡，尽可在有限的时间内培养；有些特殊类型的细胞在原代培养中分化较差，成活时间短，可获得的信息非常有限，因此原代培养的应用受到了极大的限制。所以永生化细胞系不得不被广泛应用于分子及细胞的体外研究中。
 

细胞系本质来源于肿瘤组织，表型和功能与人体内的肠上皮细胞有很大差异（Harwood et al.，2016），因此细胞系仅可作为一种人造的研究模型。
 

许多小肠细胞系不能体现出人小肠上皮细胞的典型特征，比如必需营养转运蛋白质子偶联肽转运蛋白1(proton-coupled peptide transporter 1, PEPT1)及钠依赖性葡萄糖转运蛋白1(sodium-dependent glucosetransporter , SGLT1)在小肠细胞系的表达并不高。
 

不同细胞系在不同实验室中的研究结果差异很大，CaCo-2 细胞系的这个问题尤其显著(Harwood et al., 2016;Sambuy et al., 2005)。
 

总之，肠上皮细胞系既不能保留重要的上皮特性，也不能保留其位置特异性功能，因此肠上皮细胞系在上皮细胞生物学研究中的作用非常有限。

相比之下，肠道类器官可持续培养数年，同时包含所有类型的肠上皮细胞，包括干细胞、分泌黏蛋白的杯状细胞、分泌抗菌肽的潘氏细胞(Paneth cells)、tuft 细胞、分泌激素的肠内分泌细胞(enteroendocrine cells,EECs)及肠上皮吸收细胞(Sato et al.，2009)。通过在培养基中添加肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorTNF)家族成员RANKL，肠道类器官甚至可诱导产生M细胞(de Lau et al.，2012)。在长期的培养过程中，类器官可维持各类细胞的位点特异性及基因的表达(Middendort et al.，2014)。因此，类器官可较准确地反映哺乳动物肠上皮的主要特性，可广泛应用于各类研究中。
 

肠道类器官几乎适用于所有用于分析细胞及组织样本的实验方法(Sato and Clevers2013a)，包括免疫组化、免疫荧光、原位杂交(Mahe et al.，2013)、基因和蛋白的表达分析(如RNAseq和质谱分析)(VanDussenet al，2015)、活细胞成像(Zietek et al.，2015)、代谢分析(如高分辨率细胞呼吸测定)。关于基因操控的所有分子生物学技术也可用于肠道类器官，如类器官可转染CRISPER/Cas9DNA及小干扰RNA，可感染重组病毒，可用于CreERT2体系,通过在培养基中加入他莫昔芬即可敲除加入flox序列的等位基因(Berger et al., 2016;Sato and Clevers,2013a)。
 

显微镜下的小鼠小肠类器官

肠道类器官培养体系的建立推动了胃肠道发生发展及病理学中的干细胞及分子生物学研究。随着肠道类器官的广泛应用，新的应用领域也在不停拓展。作为可准确反映体内生理特征的体外培养体系，肠道类器官可有助于显著减少研究所需的动物数量。

全组织块培养也是一种可靠的体外培养模型，小鼠的小肠组织块体外培养物可重现小肠组织中主要营养转运蛋白的表达及活动 (Roder et al., 2014)。但组织块的稳定性较差，其活性在体外仅可保留几个小时，因此仅能用于短期实验研究。组织块的成分复杂，不仅包含肠上皮细胞，还包括很多其他类型的细胞和组织，比如肌肉、结缔组织、神经和巨噬细胞等。全组织块培养并不适用于所有的科学研究，若研究者仅想对肠上皮细胞的特定功能进行研究，那么全组织块培养并不适用。
 

细胞及组织的原代培养方法均不能实现特定样本的体外扩增，动物实验需要大量小鼠样本的支持；就人体组织实验而言，伦理及组织相关问题均会限制样本的可及性。
 

总之，现有的体外研究模型均存在局限性，亟待新型模型的出现，肠道类器官培养可准确反映位置特异性肠上皮的生理学功能，同时具有操作容易、可无限扩增等优势，而且类器官可被冻存保留数年。因此，肠道类器官将有助于攻克肠上皮生物学领域中许多尚未解决的问题。

文献参考
Harwood,M.D.,Achour,B.,Neuhoff,S.,Russell,M.R.,Carlson,G.,Warhurst,G.,et al.,2016.  In vitro-in  vivo  extrapolation  scaling  factors  for  intestinal  P-glycoprotein  and  breast cancer  resistance protein:  part  I:  a  cross-laboratory  comparison  of transporterprotein  abundances  and  relative  expression factors  in  human  intestine and  Caco-2  Cells.  Drug  Metab.  Dispos.  44,297-307.
 

Sambuy,  Y. ,  De  Angelis,  I.  ,  Ranaldi,  G.  ,  Scarino, M. L. , Stammati, A. , Zucco, F. ,  2005. The Caco- 2 cell  line  as  a  model  of  the  intestinal  barrier :  influence  of  cell  and culturerelated  factors  on  Caco-2 cell  functional  characteristics.   Cell   Biol.  Toxicol. 21, 1-26.

 
Sato,T.,Vries,R.G.,Snippert,H.J.,van de Wetering, M., Barker, N. , Stange, D. E. ,et al.,2009. Single  Lgr5  stem  cells  build  crypt-villus  structures  in  vitro  without  a mesenchymal niche.  Nature. 459,  262-265.
 
de Lau,W., Kujala,P.,Schneeberger,K.,Middendorp,S.,Li,V.S.,Barker,N.,et al.,2012. Peyer's patch  M  cells  derived  from  Lgr5(1)  stem  cells  require  SpiB  and  are  induced  by RankL  in  cultured  “miniguts” .   Mol    Cell   Biol.  32,3639-3647.
 
Sato,T.,Clevers,H.,2013a.  Growing  self-organizing mini-guts  from  a  single intestinal stem  cell:mechanism and   applications.   Science.   340,1190- 1194.
 
Mahe,M.M.,Aihara,E.,Schumacher,M.A.,Zavros,Y.,Montrose,M.H.,Helmrath,M.A.,et al. 2013.  Establishment  of  gastrointestinal  epithelial  organoids.  Curr.  Protoc.  Mouse Biol.3,217-240.
 
VanDussen,K.L.,Marinshaw,J.M.,Shaikh,N.,Miyoshi,H.,Moon,C.,Tarr,P.I.,et al.,2015. Development  of  an  enhanced  human  gastrointestinal  epithelial  culture  system to facilitate  patient-based  assays.  Gut  64,911-920.
 
Zietek,T.,Daniel,H.,2015. Intestinal  nutrient  sensing  and  blood  glucose  control.
Curr.   Opin.  Clin.  Nutr.  Metab.  Care.  18,381-388.
 
Berger,E.,Rath,E.,Yuan, D.,Waldschmitt, N.,Khaloian,S.,Allgauer,M.,et al.,2016. Mitochondrial  function  controls  intestinal  epithelial  stemness  and  proliferation.
Nat.  Commun.  7,13171.
 
Roder,P.V.,Geillinger,K.E.,Zietek,T.S.,Thorens,B.,Koepsell,H.,Daniel,H.,2014.  The  role  of SGLT1  and  GLUT2  in  intestinal  glucose  transport  and  sensing.  PLoS  One. 9, e89977.

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